Obsługa kultur neuronalnych komórek macierzystych w zakładzie produkcji komórek

Streszczenie

Źródło: Stover, A. E., et al,. Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych. J. Vis. Exp. (2016).

Film przedstawia procedurę utrzymywania kontrolowanego środowiska w stacji roboczej do hodowli komórkowych dla wzrostu i utrzymania neuronalnych komórek macierzystych. Procedury te obejmują ustalenie warunków w komorze, protokoły czyszczenia i przygotowanie pożywki, dzięki czemu zachowano maksymalną sterylność i powtarzalność oraz zastąpiono tradycyjne metody.

Protokół

1. Początkowe ustawienia

1. Ustawianie stężeń gazu i temperatury
   1. Korzystając z oprogramowania, kliknij zakładkę "Gość" w lewym górnym rogu interfejsu graficznego. Zaloguj się do systemu za pomocą wyznaczonej nazwy użytkownika i hasła. Upewnij się, że każdy użytkownik ma swoją nazwę użytkownika i hasło.
   2. Kliknij moduł, aby dostosować (Rysunek 1). W nowym oknie wyświetlającym aktualne ustawienia kliknij istniejącą wartość zadaną_O2 poniżej "Wartość zadana" i wprowadź wymagany poziom stężenia O₂ dla tego modułu. Wprowadź 5% O₂ , jeśli pluripotencjalne komórki macierzyste będą hodowane lub manipulowane w tym module i 9% O₂ jeśli neuronalne komórki macierzyste będą hodowane lub manipulowane. Kliknij zielony znacznik wyboru, aby potwierdzić nastawę.
      nuta: Dwa moduły nie mają możliwości regulacji gazu: osłona laminarna i komora mikroskopu. Stężenia gazów w okapie z przepływem laminarnym są atmosferyczne, podczas gdy te w komorze procesowej pasywnie utrzymują te w komorze mikroskopu.
   3. Powtórz ten krok dla CO₂ . Wprowadzić nastawę 5% CO₂ dla wszystkich modułów z wyjątkiem komór buforowych, które dostosowują się tylko do O₂ .
   4. Monitoruj aktualne stężenia gazów oznaczone jako "wartości procesowe", aby upewnić się, że osiągają nowe nastawy.
   5. Dostosuj nastawy gazu we wszystkich modułach do odpowiednich wartości. Dopasuj poziomy CO₂ i O₂ komór, które będą narażone na wzajemne działanie. Na przykład należy ustawić komorę procesową na 5% O₂ przed otwarciem inkubatora, w którym hoduje się komórki w temperaturze 5%_O2. Zmień również na 5% O₂ w dowolnej komorze buforowej używanej do dodawania przedmiotów do komory procesowej w tym czasie.
   6. Ustaw temperaturę w komorze procesowej na 37 °C za pomocą tego samego ekranu do regulacji gazu. Również temperatura podłogi komory procesowej powinna być ustawiona na 37 °C.
   7. Kliknij na banki modułów inkubacyjnych pod każdym inkubatorem. Ustaw temperaturę banków na 37 °C.
2. Eksploatacja komór buforowych
   1. Na początku zbierz wszystkie materiały potrzebne do danego zadania (karmienie, dzielenie, barwienie itp.), aby zapobiec opóźnieniom w przepływie pracy. Obficie spryskaj wszystkie materiały 70% etanolem i pozwól im wyschnąć w okapie laminarnym. Nie spryskiwać kolb ani płytek z komórkami – przetrzyj je delikatnie sterylną gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem.
   2. Upewnij się, że zewnętrzne i wewnętrzne drzwi komory buforowej są dobrze zamknięte. Następnie otwórz drzwi zewnętrzne i umieść przedmioty w środku.
   3. Zamknij drzwi zewnętrzne. Wybierz moduł buforowy w oprogramowaniu i kliknij zakładkę współczynnika rozcieńczenia. Wprowadź jeden z nich w polu logarytmu. Kliknij przycisk start.
      Uwaga: "Współczynnik rozcieńczenia" oznacza, że atmosfera modułu buforowego zostanie opróżniona i zastąpiona czystym gazem przefiltrowanym przez HEPA.
   4. Gdy interfejs graficzny przestanie migać "współczynnik rozcieńczenia", otwórz wewnętrzne drzwiczki komory buforowej i wprowadź materiały do komory procesowej.
      Przestroga: Nie dopuścić do jednoczesnego otwarcia drzwi wewnętrznych i zewnętrznych oraz nie otwierać drzwi wewnętrznych, jeśli komora buforowa nie została poddana współczynnikowi rozcieńczenia.
   5. Najpierw wyjmij przedmioty z komory procesowej i upewnij się, że komora buforowa została poddana współczynnikowi rozcieńczenia. Następnie otwórz drzwi wewnętrzne, umieść w środku przedmioty, które mają zostać usunięte, i zamknij drzwi wewnętrzne. Następnie otwórz zewnętrzne drzwiczki i wyjmij przedmioty.
      Uwaga: Nie wolno uruchamiać współczynnika rozcieńczenia przed otwarciem drzwi zewnętrznych.

2. Wprowadzanie i karmienie komórek

1. Konfiguracja inkubatora
   1. Umieść 3 szalki Petriego w misce wodnej u podstawy każdego inkubatora. Napełnij te naczynia sterylną wodą, nie napełniając bezpośrednio patelni. Utrzymuj poziom wody w tych naczyniach, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla utrzymania nastawy wilgotności względnej (RH) inkubatorów.
   2. W interfejsie graficznym kliknij inkubator. Pod nastawą kliknij istniejącą wartość wilgotności względnej (RH) i wprowadź 85%. Kliknij zielony znacznik wyboru, aby zaakceptować tę wartość.
2. Przygotowanie zakładu produkcji ogniw do ogniw
   1. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, dostosuj komory buforowe, komorę procesową i inkubator do nastaw gazu wymaganych dla typu wprowadzanej komórki.
   2. Oczyść powierzchnię komory procesowej sterylną gazą i niepalnym środkiem dezynfekującym. Nie używaj żadnych środków dezynfekujących na bazie kwasu nadoctowego; W systemie zamkniętym silne, utrzymujące się opary są toksyczne dla komórek ssaków. Zamiast tego używaj produktów na bazie chlorku benzalkoniowego.
   3. Kontynuuj dezynfekcję. Wyczyść rękawice i powierzchnie, których często dotykasz, takie jak klamki drzwi. Używaj środka dezynfekującego dokładnie, ale oszczędnie, ponieważ nadmiar płynu w komorze procesowej przyczyni się do wilgotności, kondensacji i możliwego rozwoju drobnoustrojów.
   4. Oczyść powierzchnię okapu z przepływem laminarnym i komory buforowej 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Umieść kolbę lub płytkę z komórkami (w naszym przypadku PSC (pluripotencjalne komórki macierzyste) lub NSC (nerwowe komórki macierzyste)) w kapturze i krótko przetrzyj jej zewnętrzną powierzchnię sterylną gąbką z gazy nasączoną etanolem.
   5. Umieścić kolbę lub płytkę w komorze buforowej i uruchomić współczynnik rozcieńczenia (krok 1.2.3).
   6. Po zakończeniu pomiaru współczynnika rozcieńczania należy natychmiast przenieść kolbę lub płytkę do odpowiedniego inkubatora. Ponieważ inkubatory znajdują się z tyłu komory procesowej, wyciągnij półkę do komory procesowej w celu umieszczenia komórek. Należy unikać niepotrzebnego otwierania drzwi inkubatora lub na dłuższy czas, ponieważ powietrze w komorze procesowej jest bardzo suche w porównaniu z powietrzem w inkubatorach, co spowoduje znaczną utratę wilgotności w inkubatorze.
3. Karmienie kultur komórkowych
   1. Zebrać składniki pożywki, takie jak pipety serologiczne, pipet elektroniczny, gaza i środek dezynfekujący. Zbierz również pojemnik na odpady na pożywkę ze zużytych komórek i hodowli komórek, ale nie napełniaj go wybielaczem. Wprowadzić materiały do komory procesowej przez komorę buforową, jak opisano w sekcji 1.2. Ułóż materiały tak, aby zapewnić optymalną przestrzeń roboczą. Unikaj umieszczania przedmiotów, które nie są używane, na środku komory procesowej.
   2. Pozostawić pojemnik na pożywkę lekko niezakorkowaną, aby umożliwić zrównoważenie pożywki z poziomami CO₂ i O₂ obecnymi w systemie. Niektórzy producenci pożywek PSC zalecają, aby nie podgrzewać pożywek w temperaturze 37 ºC; Jeśli tak, użyj komory buforowej, aby zrównoważyć pożywkę. Pozwól pożywce zrównoważyć się przez 20 minut.
   3. Usunąć starą pożywkę ze studzienek za pomocą odpowiedniej pipety stereologicznej i pipetora elektronicznego. W przypadku PSC należy usunąć całą pozostałą ilość starego podłoża z wyjątkiem niewielkiej ilości, aby zapobiec wysuszeniu podczas procesu karmienia. W przypadku NSC usuń połowę starego podłoża. Odpipetować odpady do pojemnika na odpady.
   4. Zużytą pipetę należy umieścić z powrotem w oryginalnym opakowaniu i przesunąć ją na bok komory procesowej lub do komory buforowej przeznaczonej do usuwania odpadów. Za pomocą świeżej, sterylnej pipety serologicznej dodać świeżą pożywkę do płytek do kultur komórkowych i umieścić płytki z powrotem w wyznaczonym inkubatorze.
   5. Pod koniec karmienia spryskaj gazę środkiem dezynfekującym i dokładnie wyczyść podłogę i klamki drzwi komory procesowej. Jeśli w systemie hoduje się wiele linii komórkowych, sterylizuj między karmieniami każdej linii komórkowej. Pomaga to zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego.
   6. Po zakończeniu usuń odpady lub inne niepotrzebne przedmioty przez jedną z komór buforowych.

3. Dzielenie kultur komórkowych

1. Pasażowanie enzymatyczne PSC lub NSC
   1. Zbierz wszystkie przedmioty potrzebne do przejścia. Obejmuje to pożywkę, enzymatyczny lub nieenzymatyczny bufor do dysocjacji komórek (ten ostatni jest przeznaczony tylko dla NSC), DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco), płytki lub kolby, macierz zewnątrzkomórkową (ECM), stożkowe probówki i pipety serologiczne. Wprowadź je do systemu za pomocą komory buforowej.
   2. Pokryć świeże talerze lub kolby ECM, jak opisano wcześniej w punktach 9,10. Niektóre ECM - takie jak te pochodzące z linii komórkowych mięsaka myszy - są cieczą tylko w temperaturze od 4 do 15 °C, dlatego należy użyć wysterylizowanego zimnego bloku lub żelowego okładu z lodu, aby utrzymać ECM w niskiej temperaturze podczas pracy w ogrzewanej komorze procesowej.
   3. Odpipetować zużytą pożywkę z kultury i wyrzucić ją do pojemnika na odpady.
   4. Przepłukać powierzchnię studzienki lub kolby za pomocą 1 ml DPBS/studzienki i usunąć DPBS.
   5. Dodaj 1-2 ml ciepłego enzymu do każdej studzienki. Tylko bardzo gęste kultury wymagają 2 ml.
   6. Natychmiast przenieść naczynie lub kolbę hodowlaną do komory mikroskopu i obserwować kulturę. Uważaj na oznaki, że poszczególne komórki zaczynają się rozluźniać z naczynia. Nie czekaj, aż komórki uniosą się w zawiesinie, zanim przejdziesz do następnego kroku.
   7. Wróć komórki do głównej komory procesowej. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 4 ml DPBS na każdy 1 ml enzymu, a następnie mocno pipetować w górę i w dół, aby usunąć komórki z powierzchni studzienki. W przypadku przechodzenia przez wiele studzienek w płycie wielościennej, dodaj DPBS do każdej studzienki przed usunięciem komórek z poszczególnych studzienek.
   8. Przenieś enzym i zawiesinę komórek PBS do stożkowej rurki o odpowiedniej wielkości.
   9. Jeśli wirówka nie jest dostępna w zakładzie produkcji komórek, szczelnie zamknij stożkową rurkę, umieść ją w komorze buforowej i uszczelnij drzwiczki.
   10. Wyjąć rurkę stożkową z komory buforowej od strony przepływu laminarnego i obracać komórki pod ciśnieniem 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   11. Spryskaj stożkową rurkę 70% etanolem i wprowadź ją do komory procesowej za pomocą komory buforowej i współczynnika rozcieńczenia.
   12. Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki PSC lub NSC. W przypadku pasażowania PSC należy włączyć inhibitor ROCK (kinazy białkowej związanej z Rho) do pożywki w stężeniu 10 μM.
   13. Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ wymagane studzienki lub płytki. Płytka PSC o wymiarach 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ komórek/cm². Podziel NSC w stosunku 1:2.
       Uwaga: NSC często zbijają się i opierają się dokładnemu liczeniu w hemocytometrze.
   14. Jeśli wymagana jest kriokonserwacja komórek, należy upewnić się, że wszystkie materiały eksploatacyjne i środki do zamrażania są przygotowane i umieszczone w komorze procesowej. DMSO (dimetylosulfotlenek) jest bardzo toksyczny dla komórek w temperaturze 37 ºC, więc działa szybko. Pojemnik do zamrażania z płaszczem izopropanolu należy przechowywać w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym. Po napełnieniu i zamknięciu fiolek do krioprezerwacji należy je natychmiast wyjąć z komory procesowej, przepuszczając je przez komorę buforową.
2. Ręczne przechodzenie PSC
   1. Upewnij się, że kultura musi zostać przekazana, jak opisano wcześniej. Jeśli tak, przygotuj świeże płytki lub kolby pokryte macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie całkowicie zmień nośnik.
   2. Wyczyść komorę mikroskopu sterylną gazą zwilżoną niewielką ilością niepalnego środka dezynfekującego - zbyt duża ilość spowoduje nadmierne zaparowanie. Czyść tylko rękawice, powierzchnię podłogi i scenę. Do komory należy włożyć kilka oddzielnie opakowanych końcówek pipet o pojemności 200 μl lub 1 000 μl.
   3. Przenieś płytkę PSC do komory mikroskopu, zdejmij pokrywę i połóż ją ekranem do dołu na świeżo umytej podłodze. Pozostawienie pokrywy do góry naraża spód bezpośrednio na prądy powietrza i potencjalne zanieczyszczenia.
   4. Rozwiń końcówkę pipety i używając mikroskopu do wizualizacji kultury, wybierz kolonie o dobrej morfologii za pomocą końcówki pipety.
      Uwaga: Końcówka pipety może być dołączona do pipety, jeśli indywidualny użytkownik uzna to za wygodniejsze.
   5. Załóż pokrywkę na płytkę i przenieś płytkę z powrotem do komory procesowej.
   6. Odpipetować nadmiar ECM z nowej płytki i przenieść pożywkę ze starej płytki (zawierającej kawałki kolonii w zawiesinie) na nową płytkę. Jeśli stary talerz nadal zawiera kolonie, które nie są gotowe do zbioru, nakarm je również.

Wyniki

Rysunek 1. Interfejs graficzny dla zakładu produkcji ogniw. (A) Graficzna reprezentacja CPF jest ekranem domyślnym i odpowiada rysunkowi CAD pokazanemu na rysunku 3. Kliknięcie myszką na moduł buforowy 1 otwiera jego ekran kontrolny (B), na którym wartości O₂ są ustawiane tak, aby pasowały do komory przetwarzania. Podobnie, kliknięcie komory procesowej lu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System Xvivo	Biospherix (Sferyka Ekologiczna)	Wykonane na zamówienie
Oprogramowanie Xvivo	Biospherix (Sferyka Ekologiczna)	Wersja I.O.2.1.2.1
Kolektor O2	Aminokwas	P-M2H-C3-S-U-OXY
Kolektor CO2	Aminokwas	M2H-C3-D-U-CO2
Kolektor N2	Zachodni innowator	CTM75-7-2-2-BM
Gaz O2
Gaz CO2
Gaz N2
szalka Petriego
Woda
Sterylna gaza
70% etanolu	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	BDH1164-4LP
Środek dezynfekujący na bazie chlorku benzalkoniowego
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco
Bufor dysocjacji komórek oparty na Hanksie	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 13150-016
2 ml pipety serologicznej	Firma VWR	89130-894
5 ml pipety serologicznej	Olympus Plastics	12-102
10 ml pipety serologicznej	Olympus Plastics	12-104
25 ml pipeta serologiczna	Olympus Plastics	12-106
50 ml pipety serologicznej	Olympus Plastics	12-107
Płytka 6-dołkowa	Corning	353046
Końcówki do pipet 20 μl	Eppendorf	22491130
Końcówki do pipet 200 uL	Eppendorf	22491148
1000 końcówek do pipet	Eppendorf	22491156
Mikroskop z kamerą DP21 i fluorescencją	Korporacja Olympus	CKX41
Sód buforowany fosforanami	Klon	Numer katalogowy: 9236
Dimetylosulfotlenek	Protide (Protok)	Zobacz materiał PP1130
rękawiczki

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: