Linia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), HPS1006, została dostarczona przez RIKEN BRC za pośrednictwem Narodowego Projektu Zasobów Biologicznych MEXT/ AMED, Japonia.
1. Indukcja różnicowania hiPSC do śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC)
- Płytki i odczynniki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)
- Przygotować 12-dołkowe płytki pokryte matrycą błony podstawnej, rozdzielając 2,5 mg żelu matrycowego do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w celu przechowywania w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Dodać 30 ml zimnej mieszanki pożywki i składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, zmodyfikowanej przez Dulbecco, która była przechowywana w lodówce (4 °C), do probówki. Delikatnie mieszać, pipetując, aż żel się rozmrozi, a następnie dodać 500 μl roztworu do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na co najmniej 1 h.
nuta: Żel do matrycy membrany podstawnej jest wrażliwy na temperaturę i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi porcjowania i powlekania płyty. Stężenie białek macierzy zewnątrzkomórkowej może się różnić w zależności od partii. W celu zapewnienia dokładności, dokładne stężenie powinno być podane na karcie świadectwa jakości dla konkretnej partii, podając numer partii. Na przykład, jeśli dokładne stężenie wynosi 10,0 mg/ml, użyj 250 μl żelu, co daje łącznie 2,5 mg.
- Przygotować roztwór podstawowy inhibitora kinazy rolowej (ROCK), rozpuszczając inhibitor ROCK w sterylnej wodzie do stężenia 10 mM (Tabela 1). Podwielokrotnić roztwór podstawowy w objętości 100-200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
- Przygotować roztwór podstawowy kwasu L-askorbinowego o stężeniu 100 mg/ml, rozpuszczając 5 g kwasu L-askorbinowego w 50 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze -20 °C (Tabela 1). Dodaj 6,25 ml glutaminy i 305 μl roztworu podstawowego kwasu L-askorbinowego do 500 ml zaawansowanego DMEM/F12, aby uzyskać pożywkę LaSR (Tabela 1). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 2 tygodni.
- Przygotować CHIR99021 roztwór, rozpuszczając CHIR99021 w nierozcieńczonym dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 10 mM (Tabela 1). Roztwór podzielić na 100-200 μl objętości, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Porcje robocze roztworu podstawowego przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
- Przygotować pożywkę DMEM/F12-10, dodając 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do 450 ml DMEM/F12. Pożywkę należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 1 miesiąca (Tabela 1).
- Przygotować bufor przepływowy-1, dodając 33,3 ml 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 467 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) firmy Dulbecco (Tabela 1). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 6 miesięcy.
- Zasiewanie pojedynczych hiPSC i ekspansja w celu różnicowania EPC (dzień -3 do dnia -1)
- Rozpocznij różnicowanie, gdy kolonie hiPSC w 6-dołkowej płytce nie wykazują spontanicznego różnicowania i mają odpowiednią gęstość do pasażowania, zwykle około 80% konfluencji (2,5-3,5 x 106 komórek). Uważnie monitoruj spontanicznie różnicujące się komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, czy do wyeliminowania komórek niezróżnicowanych wymagane jest wiele pasaży. Zapoznaj się z uwagą podaną poniżej kroku 1.4.15, aby uzyskać informacje dotyczące pożywki do hodowli komórkowych i macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Zassać pożywkę i dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do studzienek i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C. Odessać i wyjąć komórki, delikatnie pipetując roztwór odczynnika dysocjacyjnego na powierzchnie studzienek dwa lub trzy razy.
- Przenieść odłączone komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki podtrzymującej hiPSC i dokładnie zawiesić komórki. Zarezerwować 10 μl podwielokrotności do zliczania komórek.
- Osadzać komórki przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C. Policzyć komórki i obliczyć wymaganą objętość, aby osiągnąć odpowiednią gęstość hiPSC (75-400 x 103 na studzienkę) na 12-dołkowej płytce pokrytej matrycą membrany podstawnej (etap 1.1.1).
- Odessać roztwór powlekający ze studzienek i dodać 1 ml pożywki hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do każdej studzienki (rozcieńczenie 1:1 000). Po odwirowaniu odessać supernatant i dysocjować osad w 1 ml pożywki hiPSC.
- Dodać wymaganą objętość hiPSC, oznaczoną w kroku 1.2.4, do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Dwie do czterech płytek 12-dołkowych może być wystarczające do rozróżnienia klonu hiPSC. Patrz krok 1.2.4, aby określić liczbę płytek wymaganych do wysiewu komórek.
- Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ). Równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie przesuwając płytkę do przodu i do tyłu, a następnie na boki w inkubatorze.
- Następnego dnia (tj. w dniu -2) należy wymienić pożywkę na 2 ml pożywki podtrzymującej hiPSC pozbawionej inhibitora ROCK. Następnego dnia (dzień -1) należy wymienić pożywkę na 2 ml świeżej pożywki podtrzymującej hiPSC.
- Indukcja EPC za pomocą inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK-3) CHIR99021 (Dzień 0 do Dzień 5)
- W dniu 0 zastąpić pożywkę podtrzymującą hiPSC w każdym studzience 2 ml pożywki LaSR zawierającej 8 μM CHIR99021.
- W dniu 1 odessać pożywkę i dodać 2 ml świeżej pożywki LaSR zawierającej 8 μM CHIR99021.
- W dniach 2, 3 i 4 zastąp pożywkę 2 ml świeżej pożywki LaSR bez CHIR99021.
- Magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych (MACS) w celu oczyszczenia EPC CD31+ (dzień 5)
- W dniu 5 odessać pożywkę, a następnie dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do każdego dołka, przed inkubacją przez 6-8 minut w temperaturze 37 °C.
- Zdysocjuj i pojedynczo wyizoluj komórki za pomocą mikropipety i przepuść przez sitko o wielkości 40 μm, aby przefiltrować zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki DMEM/F12-10. Przefiltrować zawiesinę komórek zebraną z więcej niż dwóch płytek 12-dołkowych do co najmniej dwóch probówek o pojemności 50 ml.
- Zatrzymaj reakcję trawienia, dodając pożywkę DMEM/F12-10 (do 50 ml). Dokładnie odpipetować i zarezerwować 10 μl do zliczenia komórek. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C.
- Po usunięciu supernatantu dodać 10 ml pożywki DMEM/F12-10 i przenieść zawiesinę komórek do świeżych probówek o pojemności 15 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić w buforze przepływowym-1 o gęstości 1,0 x 107 komórek na 100 μl buforu.
- Dodać odczynnik blokujący receptor Fc (FcR) w stosunku 1:100 i inkubować przez 5 minut przed dodaniem przeciwciała CD31 znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) rozcieńczonego w stosunku 1:200. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w ciemności w temperaturze 20-25 °C.
- Dodać 10 ml buforu przepływowego-1, rezerwując 10 μl zawiesiny do analizy cytometrii przepływowej w celu określenia frakcji komórek CD31 + (ryc. 1).
- Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić do gęstości 1,0 x 107 komórek na 100 μl roztworu buforu przepływowego-1. Dodać koktajl selekcyjny FITC (5 μl na 100 μl zawiesiny komórek). Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze 20-25 °C.
- Dodać 5 μl nanocząstek magnetycznych na 100 μl zawiesiny komórek, dobrze odpipetować i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze 20-25 °C.
- Przenieś zawiesinę komórek do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml i dodaj bufor przepływowy-1, aby uzyskać całkowitą objętość 2,5 ml. Umieść rurkę do cytometrii przepływowej w magnesie na 5 minut.
- W ruchu ciągłym odwróć magnes i zdekantuj zawiesinę komórek zawierającą komórki, które nie zostały znakowane przeciwciałem FITC-CD31. Utrzymuj magnes i rurkę w pozycji odwróconej przez 2-3 sekundy, a następnie usuń pozostały płyn. Zassać wszelkie kropelki na krawędzi rurki przed przywróceniem rurki do pozycji pionowej.
- Podnieś rurkę do cytometrii przepływowej z magnesu i dodaj 2,5 ml buforu przepływowego-1, aby umyć pozostałe komórki CD31 +. Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół dwa lub trzy razy. Umieść rurkę przepływową w magnesie na 5 minut.
- Powtórz kroki 1.4.11-1.4.12 trzy razy, a następnie krok 1.4.11 jeszcze raz, w sumie cztery prania.
- Wyjmij rurkę przepływową z magnesu i dodaj wskazaną ilość odpowiedniego podłoża (np. pożywki wolnej od ludzkiej śródbłonka [hECSR] do rozszerzonej hodowli EC lub pożywki do zamrażania) do probówki w celu ponownego zawieszenia oczyszczonych komórek CD31+. Zarezerwuj dwie podwielokrotności zawiesiny o stężeniu 10 μl, jedną do zliczania komórek, a drugą do przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek CD31 + w próbkach po MACS (ryc. 1). Jeżeli cytometr przepływowy nie jest dostępny od razu, należy przechowywać podwielokrotność w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
- W tym momencie zamroź CD31+ EPC.
nuta: 12-dołkowe płytki pokryte witronektyną i bardziej stabilne podłoże konserwacyjne hiPSC (mTeSR plus) mogą być stosowane zamiast płytek pokrytych matrycą membrany podstawnej i pożywki konserwacyjnej hiPSC (mTeSR1). Aby przygotować 12-dołkowe płytki pokryte witronektyną, należy rozcieńczyć witronektynę buforem rozcieńczającym do końcowego stężenia 10 μg/ml, a następnie przenieść 500 μl rozcieńczonego roztworu do każdego dołka z płytek 12-dołkowych. Pozostawić płytki w temperaturze 20-25 °C na co najmniej 1 godzinę. Gęstość wysiewu pojedynczych hiPSC jest porównywalna z gęstością stosowaną do płyt pokrytych matrycą membrany podstawnej. Zmiana pożywki hodowlanej lub składu matrycy może mieć wpływ na proliferację i spontaniczne różnicowanie hiPSC, które zwykle potrzebują 1-2 tygodni na przystosowanie się do nowych warunków hodowli. Jeśli do utrzymania hiPSC używana jest bardziej stabilna pożywka podtrzymująca hiPSC, może ona być używana do różnicowania EPC zamiast pożywki podtrzymującej hiPSC. W takim przypadku bardziej stabilną pożywkę podtrzymującą hiPSC należy wymienić w dniu -2 w celu usunięcia inhibitora ROCK, a wymianę w dniu -1 można pominąć.
