$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie podłoża wyjściowego i odzyskiwanie komórek macierzystych
- Przygotować podłoże hodowlane (DFHGPS), łącząc odczynniki w krokach 1.1.1.-1.1.5.
- Dodaj 210 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium z wysoką glukozą i L-glutaminą (D). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Dodaj 70 ml mieszanki składników odżywczych Ham's F12 z suplementem L-glutaminy (F). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Dodaj 4,2 ml 15 mM buforu HEPES (H) i przechowuj go w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 4,2 ml 10% roztworu D-glukozy (G) i przechowuj go w temperaturze pokojowej.
- Dodać 2,88 ml roztworu penicyliny/streptomycyny (PS). Podwielokrotność roztworu podstawowego rozdzielić na 3 ml porcji i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
nuta: Końcowe stężenie penicyliny w pożywce wyniesie 100 jednostek/ml, a stężenie streptomycyny wyniesie 100 μg/ml. To podłoże będzie określane jako DFHGPS przez pozostałą część protokołu i powinno być przechowywane w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 1-2 tygodni. W razie potrzeby DFHGPS można proporcjonalnie zwiększyć w górę.
- Dzień przed odzyskaniem komórek należy pokryć kolbę T75 5 ml kondycjonowanej pożywki uzyskanej z poprzednich kultur linii komórkowej hNSC i pozostawić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 8,5% dwutlenkiem węgla (CO2 a).
nuta: Jeśli obecnie hoduje się hNSC, zachowaj pożywkę, w której komórki rosły podczas zmiany pożywki. Jest to pożywka kondycjonowana, ponieważ została "uwarunkowana" przez komórki. Kondycjonowane podłoże można przechowywać w tubce z nakrętką i przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 7 dni. Skontaktuj się z autorem korespondencyjnym, aby otrzymać hNSC. Kondycjonowana pożywka jest preferowana, ale nie jest absolutnie wymagana, szczególnie przy pierwszym rozpoczęciu hodowli hNSC.
- W dniu rekonwalescencji ogrzej 20 ml DFHGPS w probówce z nakrętką o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut i przechowuj w łaźni wodnej do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.
- W oddzielnej probówce z nakrętką o pojemności 15 ml podgrzej 10 ml DFHGPS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut i przechowuj w łaźni wodnej do momentu, gdy będzie gotowe do użycia w kroku 1.13.
- Pobrać pojemnik z lodem i wszystkie składniki podłoża (tabela 1). Rozmrozić wszystkie składniki podłoża na lodzie i pozostawić je na lodzie, przygotowując się do zmiany podłoża.
- Uzyskać 5 ml kondycjonowanego bulionu (przechowywanego w temperaturze 4 °C) i przechowywać go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu przygotowania do użycia w kroku 1.14. Patrz uwaga po kroku 1.2, jeśli nie ma kondycjonowanej pożywki lub aktualnej hodowli ludzkich płodowych nerwowych komórek macierzystych.
- Wyjmij zakrętkę o pojemności 50 ml z kroku 1.3 i umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Przenieść 10 ml DFHGPS do nowej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, a następnie umieścić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą pozostałe 10 ml pożywki DFHGPS z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Uzyskać kriofiolkę z hNSC przechowywanymi w ciekłym azocie. Patrz uwaga po kroku 1.2, jeśli nie ma aktualnej hodowli ludzkich płodowych nerwowych komórek macierzystych.
nuta: Ludzkie nerwowe komórki macierzyste pierwotnie pochodziły z odrzuconych mózgów płodów ludzkich12 i były utrzymywane w hodowli bez modyfikacji genetycznych10. 5 × 106 komórek należy rozmrozić i posiać na kolbie T75. Każda kriofiolka powinna zawierać od 5 × 106 komórek; Z tego powodu potrzebna jest jedna fiolka na kolbę.
- Rozmrozić fiolkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając fiolkę co 10 s przez około 1 minutę lub do momentu, gdy lód się rozpuści, a zawartość fiolki stanie się całkowicie płynna. Nie zanurzać całej fiolki pod wodą, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia.
- W BSC użyj mikropipety P1000 do zasysania rozmrożonego roztworu komórek i dodaj go kroplami do probówki 15 ml z kroku 1.7, zawierającej 10 ml DFHGPS. Aby dodać kroplami rozmrożony roztwór komórek, powoli naciskaj tłok, tak aby uwolnić tylko jedną lub dwie krople na raz. W międzyczasie zakręć probówką o pojemności 15 ml, aby umożliwić szybkie wymieszanie.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant, upewniając się, że pozostał osad komórkowy.
- W kroku 1.11 wyjmij probówkę o pojemności 50 ml zawierającą pozostałe 10 ml z kroku 1.7. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DFHGPS i ponownie odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Podczas ostatniego wirowania przygotuj nową pożywkę wzrostową, postępując zgodnie z tabelą 1, aby dodać czynniki wzrostu do 10 ml pożywki DFHGPS z kroku 1.4 (Tabela 1) w BSC. Pozostawić nową pożywkę zawierającą czynniki wzrostu w BSC do momentu przygotowania do użycia.
- Wyjąć kolbę T75 z kroku 1.2 i wyrzucić kondycjonowane podłoże pokrywające kolbę przez aspirację. Następnie dodaj 5 ml kondycjonowanej pożywki z kroku 1.6. do kolby za pomocą pipety serologicznej. Uważaj, aby nie zarysować dna kolby.
- Pobrać probówkę z komórkami z wirówki i wyrzucić supernatant przez zasysanie go, pozostawiając nienaruszoną osadkę komórkową.
- Zawiesić osad komórkowy w 10 ml nowej pożywki z kroku 1.13, używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml i kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Dodać zawiesinę do powlekanej kolby T75 z kroku 1.14. Użyj pozostałych 5 ml do przepłukania probówki, w której znajdowały się osady komórek, a następnie dodaj te 5 ml również do kolby.
- Obróć kolbę T75 w przód i w tył 3 razy, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w kolbie. Upewnij się, że nasadka kolby jest luźna, aby umożliwić przepływ powietrza. Pod mikroskopem świetlnym obserwuj komórki, rób notatki i rób zdjęcia, jeśli to możliwe.
nuta: Komórki powinny wyglądać na półprzezroczyste i kuliste. Zanotuj, czy istnieją komórki, które wyglądają na ciemne, nieprzezroczyste lub mają asymetryczne obramowania, ponieważ może to wskazywać na śmierć komórki. Uważaj również na wszelkie zanieczyszczenia grzybicze lub bakteryjne, takie jak żółknięcie podłoża.
- Umieścić kolbę komórkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C o zawartości 8,5% CO2,
nuta: Stosować 8,5% zamiast 5,0% CO2 , aby utrzymać pH tej pożywki hodowlanej bez surowicy w zakresie 7,1-7,4.
2. Średnia zmiana hNSC
UWAGA: Zmieniaj medium co 3-4 dni.
- Włącz BSC i dokładnie wyczyść 70% etanolem. Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym.
nuta: Rób notatki na temat wyglądu komórek i rozmiarów sfer. Trzy dni po wyzdrowieniu lub przejściu komórki skupiają się razem i zaczynają tworzyć nieprzylegające neurosfery.
ostrożność: Jeśli komórki przylegają do dna kolby, hodowla będzie musiała zostać odrzucona, ponieważ przyleganie komórek zwiększy przedwczesne różnicowanie, a komórki nie będą w stanie utrzymać stanu macierzystego. Jeśli w kolbie znajduje się zbyt wiele komórek, komórki mogą tworzyć duże kule (o średnicy większej niż 2 mm), w takim przypadku komórki w środku kuli zaczną się różnicować z powodu braku dostępu do czynników wzrostu w pożywce. Jeśli zaobserwuje się kule o średnicy większej niż 1 mm, komórki mogą zostać przepuszczone (kroki 3.1-3.22).
- Wykonaj kroki 1.4 i 1.5 i przygotuj 10 ml świeżej pożywki (patrz krok 1.13).
- Przechylić kolbę na bok, pozwalając kulkom opaść na dno kolby.
- Usunąć 5 ml kondycjonowanej pożywki z górnej części zbiorczej pożywki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, uważając, aby nie zassać żadnych neurosfer. Umieść 5 ml kondycjonowanej pożywki w czystej probówce o pojemności 15 ml.
- Wyjąć dodatkowe 5 ml kondycjonowanej pożywki z kolby, ponownie ostrożnie omijając kulki, i umieścić 5 ml w tej samej probówce o pojemności 15 ml.
- Dodać 10 ml nowej pożywki z kroku 2.2 do pozostałych 5 ml kondycjonowanej pożywki i komórek w kolbie. Odłóż kolbę płasko i obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym.
- Jeśli okaże się, że komórki zostały zassane podczas pobierania kondycjonowanej pożywki, należy wirować kondycjonowane podłoże o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić wszystkie komórki, które gromadzą się na dnie, w 1 ml kondycjonowanej pożywki, a następnie dodać je do kolby hodowlanej.
- Przechowywać 10 ml niewykorzystanego kondycjonowanego podłoża z etapów 2.5/2.6 w temperaturze 4 °C w probówce z nakrętką o pojemności 15 ml.
- Powtórz kroki 1.17/1.18.
3. Przejście hNSC
- W przypadku rozszerzania NSC do nowej kolby, należy upewnić się, że wszystkie nowe kolby są pokryte jak w kroku 1.2.
- Oczyść BSC jak w kroku 2.1 i wykonaj kroki 1.4 i 1.5.
- Przygotować podłoże jak w kroku 1.13. Każda kolba T75 wymaga 10 ml pożywki. W przypadku wielu kolb T75 należy pomnożyć 10 ml pożywki przez liczbę kolb.
- Przygotować 1 lub 3 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (dPBS) i glukozy firmy Dulbecco i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do ogrzania na 10 minut (dla roztworu trypsyny) zgodnie z objętościami podanymi w tabeli 2. W tym momencie nie dodawaj trypsyny ani DNazy. DNaza może być wymagana do rozbicia DNA uwolnionego z martwych komórek w wyniku mechanicznej lub chemicznej dysocjacji komórek.
UWAGA: Dla jednej kolby T75 pasażowanej po 9-10 dniach wzrostu, będzie około 30 × 106 komórek, jeśli 5 × 106 zostało pierwotnie wysianych na kolbie. Zazwyczaj 1 ml roztworu dPBS stosuje się na 10 × 106 komórek. Dlatego do kolby T75 przepasażowanej po 9-10 dniach potrzebne są 3 ml roztworu dPBS.
- Umieść czystą małą łódź do ważenia i hemocytometr w masce. Wyczyść 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w okapie przez około 5 minut.
nuta: Łódź wagowa zostanie użyta w krokach 3.17.1.
- Pobrać kolbę z komórkami, które zostaną wyjęte z inkubatora i wprowadzić do BSC. Delikatnie przechylić kolbę, pozwalając komórkom opaść na dno zebranej pożywki. W kolbie znajduje się około 15 ml pożywki.
- Usunąć około 10 ml pożywki w porcjach po 5 ml (tj. 5 ml + 5 ml). Umieść te 10 ml pożywki w czystej 15 ml probówce oznaczonej "CM" dla "kondycjonowanego podłoża". Należy uważać, aby nie zassać żadnej z komórek osadzonych w pozostałych 5 ml pożywki w kolbie; komórki te i 5 ml pożywki zostaną poddane krokowi 3.8.
- Pobrać 3 ml kondycjonowanej pożywki z probówki "CM" (z kroku 3.7) i umieścić w 15 ml probówce oznaczonej jako "roztwór inhibitora trypsyny". Zostanie to użyte w kroku 3.12. Po wyjęciu 3 ml w probówce "CM" pozostaje 7 ml kondycjonowanej pożywki. Odłóż rurkę "CM" na bok do kroku 3.9.
- Usunąć 5 ml pożywki i komórek pozostałych w kolbie T75 i umieścić w czystej probówce o pojemności 15 ml oznaczonej "Komórki".
- Pobrać probówkę "CM" zawierającą 7 ml kondycjonowanej pożywki (z kroku 3.7.1) i dwukrotnie przepłukać dno kolby T75 porcjami kondycjonowanej pożywki o objętości 3,5 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Po każdym płukaniu umieść porcje 3,5 ml w probówce "Cells". Celem tego etapu jest usunięcie wszystkich neurosfer (komórek) z kolby T75.
- Odwirować probówkę "Komórki" o masie 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Podczas wirowania komórek należy pobrać roztwór dPBS/glukozy z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i dodać odpowiednią ilość trypsyny i DNazy zgodnie z tabelą 2.
- Po tym, jak probówka "Komórki" przestanie się obracać, usuń cały kondycjonowany supernatant pożywki i przenieś do probówki "CM".
- Pobrać probówkę oznaczoną jako "roztwór inhibitora trypsyny" z kroku 3.7.1 i dodać objętość inhibitora trypsyny wskazaną w Tabeli 3. Użyj tej samej objętości roztworu inhibitora trypsyny, jaka została użyta do roztworu trypsyny.
- Umieścić roztwór inhibitora trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebny.
- Dodaj roztwór trypsyny do osadu komórkowego w probówce o pojemności 15 ml i pipetuj w górę i w dół około 5-10 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Zamknąć nakrętkę probówki i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach wyjmij komórki i pipetuj w górę i w dół 5-10 razy. Następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez dodatkowe 10-15 minut.
- W ciągu ostatnich 5 minut przenieś roztwór inhibitora trypsyny do BSC.
- Pobrać komórki po zakończeniu kroku 2.14 i pipetować komórki w górę i w dół, aż kulki zostaną całkowicie rozdzielone (20-30 razy). Następnie natychmiast dodaj roztwór inhibitora trypsyny i pipetuj w górę iw dół 10 razy. Ten roztwór zdysocjowanych komórek i inhibitora trypsyny będzie określany jako "zawiesina komórkowa".
- Policz liczbę komórek w zawiesinie komórek, wykonując następujące czynności.
- Odpipetować 15 μl wstępnej mieszaniny błękitu trypanowego (zawierającej 5 μl 0,4% błękitu trypanowego i 10 μl dPBS) na małą łódkę wagową, a następnie dodać 5 μl zawiesiny komórek. Pipetować w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać. Następnie odpipetować 10 μl zawiesiny błękitu trypanowego/komórek po obu stronach hemocytometru pokrytego szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
- Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym i policz całkowitą liczbę komórek w każdej z czterech siatek narożnych. Dodaj te liczby do siebie.
- Powtórz liczenie dla drugiej strony i uśrednij obie strony razem.
- Pomnóż tę liczbę przez 10 000, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek na ml. Pomnóż tę liczbę przez całkowitą liczbę mililitrów, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek w zawiesinie komórek. Oblicz, jaka objętość zawiesiny komórek będzie potrzebna do wysiewu 5 milionów komórek w kolbie T75.
nuta: Zazwyczaj po 9-10 dniach T75 będzie miał 25-30 × 106 komórek. Dlatego, jeśli wszystkie komórki są przenoszone do nowych kolb, potrzeba w sumie 5-6 kolb.
- Dodać objętość zawiesiny komórek obliczoną w kroku 3.19 do każdej kolby T75, aby uzyskać 5 × 106 komórek na kolbę. Jeśli objętość jest mniejsza niż 5 ml, dodaj dodatkową pożywkę, aby uzyskać łącznie 5 ml. Następnie dodać do kolby 10 ml nowej pożywki DFHGFPS zawierającej czynniki wzrostu (Tabela 1).
- Powtórzyć kroki 1.17 i 1.18 i upewnić się, że kolba jest oznaczona typem komórek, datami, liczbą komórek w kolbie i numerem przejścia (jest to liczba pasaży w komórce). Następnie przejdź do kroku 4.
- W razie potrzeby wysiewać dodatkowe komórki do jednej kolby T75 o gęstości do 30 × 106 komórek na kolbę przez noc i zamrozić następnego dnia zgodnie z krokiem 4.
4. Zamrażanie i przechowywanie hNSC
- Następnego dnia po pasażowaniu wyjąć kolbę z inkubatora zawierającą komórki do zamrożenia (z etapów 3.19 i 3.22). Przechylić kolbę i usunąć z niej całe podłoże oraz komórki, a następnie umieścić w probówce o pojemności 15 ml. Następnie odwirować probówkę o sile 216 x g przez 5 minut.
- Podczas procesu wirowania należy przygotować pożywkę do zamrażania (tabela 4). Na każde 5 × 106 komórek przygotuj 1 ml pożywki do zamrażania. Liczba komórek została określona w kroku 3.19 podczas określania, ile komórek należy umieścić w każdej kolbie. Liczba ta nie zmieni się z dnia na dzień.
- Przygotuj fiolki do kriopów z etykietami z nazwą komórki, numerem przejścia, numerem komórki, inicjałami i datą. Po odwirowaniu usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce zamrażającej, tak aby pozostało 5 × 106 komórek/ml. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml podać porcję 1 ml na fiolkę i szczelnie zamknąć (5 × 106 komórek na fiolkę).
- Umieść fiolki w pojemniku do kriokonserwacji z 250 ml izopropanolu (maksymalne użycie to 5 razy na wymianę izopropanolu). Przechowywać przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C, a następnie przenieść do systemu przechowywania ciekłego azotu.
5. Poszycie przylegające do hNSC do walidacji
- Dzień przed pasażowaniem (kroki 3.1-3.22) oczyścić BSC jak w kroku 2.2 i uzyskać 24-dołkową płytkę i sterylne szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm.
- Za pomocą kleszczy umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe na dnie każdego dołka płytki.
- Studzienki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryć 0,01% poli-D-lizyną (PDL) w sterylnej wodzie i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W przypadku płytki 24-dołkowej należy użyć 250 μl PDL na dołek.
- Usunąć PDL z dołków, a następnie pokryć go 1 μg/cm2 lamininy/dPBS (250 μl na studzienkę). Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Jeśli nie jest to potrzebne następnego dnia, należy uszczelnić płytkę parafilmem, owijając go wokół krawędzi płytki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
nuta: Płytki pokryte lamininą można przechowywać do 2 tygodni, jeśli zostaną uszczelnione parafilmem, o ile szkiełka nakrywkowe nie wyschną.
- Pasaż komórek zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.22, a następnie określ liczbę komórek do wysiewu do 24-dołkowej płytki z powlekanymi szkiełkami nakrywkowymi.
- Usunąć nadmiar roztworu lamininy ze studzienek poprzez aspirację i spłukać raz 0,5 ml dPBS. Następnie umieść komórki nasienne w studzienkach o gęstości 0,6-1 x 105 komórek/cm2 na dołek. Użyj pozostałych komórek zgodnie z krokami 3.16-3.21.
- W różnych momentach hodowli na płytce 24-dołkowej należy utrwalić i wybarwić komórki pod kątem różnych markerów komórek macierzystych.