$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Generowanie agregatów iPSC
- Wytwarzanie jednokomórkowych kultur jednowarstwowych z kolonii iPSC
- Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą ekstraktem z błony podstawnej (BME). Rozmrażać BME na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny, rozcieńczyć zimnym zmodyfikowanym medium Eagle F12 firmy Dulbecco (DMEM-F12; rozcieńczenie 1:50), przykryć płytkę 1 ml/studzienkę rozcieńczonego roztworu BME i przechowywać płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
- Odessać pożywkę i przemyć nienaruszone kolonie iPSC z co najmniej dwóch dołków 6-dołkowej płytki 0,5 mM EDTA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dwa razy przed inkubacją kolonii z 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Odessać roztwór EDTA i delikatnie odłączyć kolonie, zmywając je z dna naczynia 5 ml pożywki DMEM-F12. Zbierz je do probówki o pojemności 15 ml i zagnieźdź przez odwirowanie (4 min przy 1,200 x g przy RT).
UWAGA: Z powodzeniem zastosowano iPSC przeprogramowane z dostępnych na rynku fibroblastów.
- Odessać supernatant i inkubować kolonie iPSC z 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek przez 6 minut w temperaturze 37 °C.
- Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby rozbić pozostałe skupiska komórek na pojedyncze komórki.
- Dodać 4 ml DMEM-F12 do zawiesiny komórek, aby rozcieńczyć odczynnik do dysocjacji komórek.
- Wiruj komórki w dół przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki iPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632 i komórkach nasiennych w jednym dołku 6-dołkowej płytki pokrytej BME.
nuta: Użyć pożywki iPSC określonej w Tabeli materiałów dla jednokomórkowych monowarstwowych kultur iPSC.
- Następnego dnia zastąp pożywkę nową pożywką iPSC, na której brakuje Y-27632. Od tego momentu kontynuuj hodowlę komórek, zmieniając pożywkę każdego dnia, aż iPSC będą w 100% zlewne. W zależności od linii komórkowej i zbiegu studzienek początkowych zajmie to od 2 do 4 dni.
- Po zlaniu się przejdź przez iPSC. Odessać pożywkę i nałożyć 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na komórki.
- Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie kołysać płytką, aby oderwać komórki.
- Umyj komórki ze studzienki za pomocą 2 ml DMEM-F12 i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj DMEM-F12 do całkowitej objętości 5 ml.
- Wirować komórki przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
- Wysiewać komórki w pożywce iPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632 w stosunku 1:2 do 1:4 na 6-dołkowej płytce pokrytej BME (2 ml / dołek pożywki).
- Kontynuuj hodowlę komórek przez 2-5 dni i codziennie zmieniaj pożywkę iPSC, w której brakuje Y-27632. Po zlewaniu się przechodzą iPSC (kroki 1.1.4-1.1.8).
nuta: Hodowla iPSC przez co najmniej 2 pasaże jako monowarstwa w pożywce iPSC określonej w tabeli materiałów przed użyciem ich do wytworzenia agregatów iPSC, aby umożliwić komórkom przystosowanie się do warunków hodowli.
- Do wytwarzania agregatów iPSC należy stosować jednowarstwowe kultury iPSC, gdy zlewają się one w 70-90%.
UWAGA: iPSC dostosował się do warunków hodowli, ponieważ pojedyncze komórki są mniej podatne na stres, który prowadzi do śmierci komórki podczas procedury dysocjacji i agregacji. Jednowarstwowe kultury iPSC muszą wykazywać typową morfologię pluripotencjalną bez dowodów na różnicowanie. Regularnie testuj kultury pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Pracuj tylko z kulturami iPSC wolnymi od mykoplazmy.
- Odessać pożywkę hodowlaną z jednego dołka na płytce 6-dołkowej i nałożyć 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na komórki.
- Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie kołysać płytką, aby oderwać komórki.
- Umyj komórki ze studzienki za pomocą 2 ml DMEM-F12 i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj DMEM-F12 do całkowitej objętości 10 ml.
- Do zliczania komórek należy pobrać 25 μl z zawiesiny komórek i wymieszać je z 25 μl błękitu trypanowego, aby oznaczyć martwe komórki. Policz żywe komórki za pomocą komory liczącej.
- Zbierz wystarczającą ilość komórek (4,500 komórek na agregat iPSC) z zawiesiny komórek w probówce o pojemności 15 ml.
- Wirować komórki przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki iPSC uzupełnionej 50 μM Y-27632, aby uzyskać 4 500 żywych komórek na 150 μL.
nuta: Stosowanie wysokiego stężenia Y-27632 (50 μM) ma kluczowe znaczenie dla przetrwania iPSC.
- Umieścić 150 μl w każdym dołku 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U o niskiej przyczepności i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
nuta: Generując agregaty iPSC, należy wziąć pod uwagę, że do kontroli jakości w 20. dniu potrzebnych jest co najmniej 6 organoidów (zob. sekcja 5).
2. Indukcja neuroektodermy przedniej
- Uważnie monitoruj zmiany morfologii agregatów iPSC każdego dnia pod mikroskopem hodowli tkankowych za pomocą soczewki o dużej mocy 4X lub 10X. Obserwuj w dniu 1, agregaty komórek z wyraźnymi granicami. Kontynuować hodowlę agregatów iPSC w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
nuta: Pewna liczba martwych komórek/studzienki jest normalna i nie wpływa na wytwarzanie organoidów.
- Podawaj agregaty iPSC począwszy od 2 dnia i kontynuuj co drugi dzień, delikatnie zasysając około 2/3 pożywki bez naruszania agregatów komórkowych na dole. Dodać dodatkowe 100 μl pożywki iPSC bez Y-27632.
nuta: W ciągu 4-6 dni agregaty komórkowe będą miały średnicę 350-450 μm i gładkie krawędzie.
- Na tym etapie zebrać agregaty komórek za pomocą wyciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl w naczyniu o średnicy 6 cm o niskim stopniu mocowania (maksymalnie 20 agregatów/szalkę) w pożywce do indukcji kory zawierającej DMEM-F12 z dodatkiem N2 (1:200), suplementem B27 (1:100), glukozą (0,2 mg/ml), cyklicznym monofosforanem adenozyny (cAMP; 0,15 μg/ml), 0,5% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% L-alanylo-L-glutamina, heparyna (10 μg/ml) oraz związki LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) i inhibitor odpowiedzi Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/ml). Nakarm agregaty komórkowe, zmieniając pożywkę indukcyjną kory mózgowej 3 dni po przeniesieniu ich do 6-centymetrowej płytki.
- Ściśle monitoruj zmiany morfologiczne podczas indukcji kory mózgowej pod mikroskopem hodowli tkankowej za pomocą soczewki o mocy 4X.
nuta: Po 4-5 dniach w pożywce indukcyjnej korowej krawędzie agregatów komórkowych powinny zacząć rozjaśniać się na powierzchni, wskazując na różnicowanie neuroektodermalne. Na tym etapie pojawia się promienista organizacja pseudowarstwowego nabłonka. Przejdź do sekcji 3, aby osadzić agregaty komórek w matrycy BME.
3. Osadzanie agregatów neuroektodermalnych w rusztowaniu matrycowym
- Rozmrażać BME na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny. Podwielokrotność nierozcieńczonego BME w wystarczających ilościach.
- Przygotuj arkusz folii parafinowej z tworzywa sztucznego do procedury zatapiania. Przetnij plastikową folię parafinową za pomocą sterylnych nożyczek na kawałki o wymiarach 4 cm x 4 cm, połóż kawałek plastikowej folii parafinowej na pustej tacce na końcówki o pojemności 100 μl na końcówki o pojemności 100 μl i dociśnij palcem w rękawiczce, aby powstały małe wgłębienia w plastikowym arkuszu folii parafinowej (potrzebny 1 wgłębienie/agregat komórek). Oczyść plastikową folię parafinową z 70% etanolem i naświetl ją światłem UV (moc: 15 watów, długość fali: 435 nm) pod zamkniętą sterylną ławą przez 30 minut.
- Przenieś każdą agregację komórek do jednego wgłębienia w arkuszu folii parafinowej z tworzywa sztucznego za pomocą końcówki o pojemności 100 μl z otworem o średnicy 1,5-2 mm. W przypadku, gdy dwa agregaty komórek są połączone, nie rozdzielaj ich, ale przenieś je razem do jednego wgłębienia.
- Delikatnie zassać pożywkę otaczającą agregaty komórek za pomocą nieoszlifowanej końcówki do pipety o pojemności 100 μl.
nuta: Uważaj, aby nie zassać agregatów komórek do końcówki, ponieważ spowoduje to uszkodzenie agregatów.
- Dodać 40 μl nierozcieńczonego BME do każdego agregatu komórek.
- Umieść każdą grupę komórek w środku kropli BME za pomocą nieobciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl.
nuta: Bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić rozwijającego się nabłonka nerwowego końcówką pipety.
- Ostrożnie przenieś plastikowy arkusz folii parafinowej za pomocą sterylnych kleszczy na 10-centymetrową szalkę Petriego (lub inną wystarczającą ilość naczyń do hodowli komórkowych) i umieść naczynie w inkubatorze na 15-20 minut, aby umożliwić zestalenie się BME.
- W międzyczasie przygotuj 6-centymetrowe naczynie o niskim stopniu przystawki, zawierające 5 ml pożywki do indukcji korowej.
- Po polimeryzacji BME należy usunąć kropelki zawierające agregaty komórkowe z arkusza folii parafinowej z tworzywa sztucznego. Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć plastikową folię parafinową i delikatnie wyciśnij agregaty komórek do lekko pochylonego (około 30 °) nisko przylegającego naczynia o średnicy 6 cm, aż kropelki spadną z plastikowego arkusza folii parafinowej. Przenieść maksymalnie 16 agregatów komórek do jednego naczynia o średnicy 6 cm.
- Kontynuować inkubację agregatów komórkowych w temperaturze 37 °C.
4. Generowanie organoidów typu przodomózgowia z agregatów neuroektodermalnych
- Jednego dnia po umieszczeniu w matrycy BME umieścić szalki z kulturami organoidowymi na kołyszącym się wytrząsarce do kultur komórkowych o kącie nachylenia 5 ° i 14 obr./min, zainstalowanej w inkubatorze do hodowli komórkowych.
- Monitoruj organoidy każdego dnia. Jednorodne struktury przypominające pętlę neuroepitelialną rozwijają się stopniowo po osadzeniu w macierzy BME.
- Gdy widoczne są struktury pętli neuroepitelialnej, należy zmienić pożywkę na pożywkę różnicującą organoidy zawierającą DMEM-F12 z suplementem N2 (1:200), suplementem B27 (1:100), glukozą (0,2 mg/ml), cAMP (0,15 μg/ml), 0,5% NEAA, 1% L-alanylo-L-glutaminą, insuliną (2,5 μg/ml)
- Pożywkę do różnicowania organoidów należy wymieniać co 3-4 dni, aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego różnicowania. Następnie napraw organoidy (patrz sekcja 5).
nuta: Czasami w tkance mogą pojawiać się zawiązki optycznie przezroczystej tkanki bez struktur pętelkowych. Chociaż nie jest to rozwiązanie idealne, nie wpływa to na rozwój struktur korowych. Organoidy można hodować w pożywce do różnicowania organoidów przez okres do 40 dni. W przypadku dłuższych okresów hodowli (40-100 dni) pożywkę różnicującą organoidy można uzupełnić 1:50 BME w celu zwiększenia złożoności tkanek oraz BDNF i GDNF, aby umożliwić przeżycie i dojrzewanie neuronów.