Mikrofabrykowane detektory post-macierzowe (mPADs): podejście do izolacji sił mechanicznych

Podsumowanie

W tym filmie pokazujemy, jak wyprodukować i wykorzystać mikrofabrykowane detektory post array (mPADs) do oceny modulacji kurczliwości komórek.

Streszczenie

W tym filmie przedstawimy nasze podejście do pomiaru sił trakcji komórkowej za pomocą mikroprefabrykowanego zestawu słupków. Siły trakcyjne są generowane przez interakcje miozyna-aktyna i odgrywają ważną rolę w naszej fizjologii. Podczas rozwoju umożliwiają komórkom przemieszczanie się z jednego miejsca do drugiego w celu utworzenia wczesnych struktur tkanki. Siły trakcyjne pomagają w procesach gojenia. Są one niezbędne do prawidłowego zamykania ran czy migracji i pełzania leukocytów po naszym organizmie. Te same siły mogą być szkodliwe dla naszego zdrowia w przypadku przerzutów raka lub rozrostu naczyń w kierunku guza. Najpowszechniejszą metodą badania komórek in vitro było użycie naczynia szklanego lub polistyrenowego. Jednak sztywność substratów uniemożliwia fizyczny pomiar sił trakcyjnych komórek, a metod badania sił trakcyjnych jest stosunkowo niewiele. Nasze laboratorium opracowało technikę pozwalającą przezwyciężyć te ograniczenia. Metoda opiera się na pionowym układzie elastycznych wsporników, których sztywność i skala rozmiarów są takie, że poszczególne komórki rozchodzą się na wielu wspornikach i odchylają je w tym procesie. Używane przez nas filary mają średnicę 3 μm, wysokość 10 μm i są skonfigurowane w regularny układ z odstępami 9 μm od środka do środka. Ale te fizyczne wymiary mogą być łatwo zmieniane, aby dostosować się do różnych badań. Zaczynamy od mistrza silikonowego, ale końcowe słupki są wykonane z kauczuku silikonowego zwanego poli (dimetylosiloksan) lub PDMS. Możemy zmierzyć ugięcia pod mikroskopem i obliczyć wielkość i kierunek sił trakcyjnych wymaganych do wytworzenia obserwowanych ugięć. Podłoża te nazywamy mikrofabrykowanymi detektorami post-array lub mPAD. Tutaj pokażemy Ci, w jaki sposób wytwarzamy i wykorzystujemy mPADy do oceny modulacji kurczliwości komórek.

Protokół

Silicon Master Mold Fabrication

Litografia

Materiały:

• Wafle krzemowe 75 mm
• SU-8 2 Fotorezystor ujemny (Microchem, Boston, MA)
• N2

Metoda:

1. Odwodnić wafel Si w temperaturze 120 °C przez 2 godziny.
2. Ozon UV traktuj powierzchnię przez 7 minut w celu usunięcia substancji organicznych.
3. Powierzchnia nadmuchu N2 do usuwania cząstek stałych.
4. Nałożyć SU-8 2 na pokrycie 70% powierzchni (~10 ml dla wafla 75 mm).
5. Wiruj z prędkością 2000 obr./min przez 20 sekund z przyspieszeniem 300 obr./min/s.
6. Umieść wafel na płycie grzejnej i zwiększ temperaturę z pokojowej do 95 °C.
7. Piecz fotorezystor na miękko przez 15 minut w temperaturze 95 °C.
8. Płytkę zalewową należy wystawić na dawkę 20 - 25 mJ/cm2 przy długości fali 365 nm (linia I), aby utworzyć dolną warstwę.
9. Nałożyć SU-8 2 na drugą warstwę fotorezystu.
10. Wiruj z prędkością 550 obr./min przez 20 sekund z przyspieszeniem 300 obr./min/s, aby uzyskać folię o grubości około 11 μm.
11. Umieść wafel na płycie grzejnej i rampie od temperatury pokojowej do 65 °C.
12. Piecz wafelek na miękko w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
13. Zwiększ temperaturę płyty grzejnej z 65 °C do 95 °C.
14. Piecz wafelek na miękko przez 55 minut w temperaturze 95 °C.
15. Schłodzić wafel do temperatury pokojowej przez 20 minut.
16. Wyrównaj maskę mPAD na płytce i naświetl na dawkę 95 - 100 mJ/cm2 przy 365 nm (I-line).
17. Umieść wafel na płycie grzejnej i zwiększ temperaturę z pokojowej do 95 °C.
18. Po naświetleniu wypiekać fotorezystor przez 25 minut w temperaturze 95 °C.

Develop

Materiały:

• Naczynia szklane 100mm (5)
• Octan eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA)
• Izopropanol (IPA)
• N2

Metoda:

1. W okapie chemicznym napełnij pięć naczyń PGMEA (2), IPA i heksanem (2).
2. Przytrzymaj wafel w 1. PGMEA przez 10 sekund
3. Mieszaj wafel przez 50 sekund
4. Przenieś wafel do 2. PGMEA z łąkotką PGMEA.
5. Mieszaj przez 5 sekund.
6. Przenieś wafel do IPA z łąkotką PGMEA.
7. Mieszaj przez 20 sekund.
8. Przełóż wafel do 1. IPA.
9. Mieszaj przez 5 sekund.
10. Przenieś wafel do 2nd IPA.
11. Mieszaj przez 5 sekund.
12. Szybko usuń wafel z 2nd IPA za pomocą menisku IPA i osusz za pomocą N2
13. Sprawdź wzorzec.
14. Piecz wafel w temperaturze 120 °C przez 14-20 godzin, aby usieciować SU-8.
15. Wafel pokroić w kostkę za pomocą frezu diamentowego
16. Zamontuj wafel na szkiełku podstawowym za pomocą żywicy epoksydowej
17. Fluoryzuj płytkę (patrz instrukcje dotyczące formowania replikacyjnego)

Formowanie replikacji mPADS

Negative Mold

Materiały:

• Jednorazowa aluminiowa łódź ważąca
• Baza polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz (Dow, Midland, MI)
• Ostrze brzytwy
• Silan: (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahyrooktylo)-1-trichlorosilan
• Zjeżdżalnia szklana
• Szklana pipeta Pasteura

Metoda:

1. Wymieszaj PDMS 10:1 wagowo i odgazuj w próżni przez 1 godzinę, aby usunąć pęcherzyki.
2. Umieść silikonową formę główną w aluminiowej łodzi.
3. Wlej 50 – 60 g PDMS na formę główną w aluminiowej łódce.
4. Odgazuj pod próżnią przez 30 minut, aby usunąć pęcherzyki.
5. Wydmuchuj uwięzione na powierzchni pęcherzyki powietrza w PDMS za pomocą szybkiego podmuchu N2.
6. Umieść łódź w piecu konwekcyjnym w temperaturze 110 °C na 15 minut, aż PDMS będzie twardy.
7. Odetnij aluminiową łódź.
8. Za pomocą żyletki odetnij PDMS pod silikonowym masterem.
9. Odklejaj PDMS od wzorca krzemowego powoli i ciągłym ruchem w jednym kierunku, aby uniknąć zniszczenia wzorca.
10. Sprawdź wzorzec krzemowy pod kątem uszkodzeń.
11. Pokrój formę negatywową na 4 części.
12. Powtórz kroki 1-10 dla dużej partii form negatywowych.
13. Plazma tlenowa traktuje ujemną pleśń przez 1,5 minuty, aby aktywować powierzchnię lub
14. Ozon traktuje negatywną pleśń przez 10 minut, aby aktywować powierzchnię.
15. Umieść formy ujemne w eksykatorze z odsłoniętymi cechami mPAD.
16. Rozprowadzić 250-500 μl silanu na szkiełku podstawowym w środku eksykatora
17. Umieścić szklaną pipetę pastwiskową ze 150-200 μl silanu w końcówce wewnątrz eksykatora.
18. Komora próżniowa do odparowywania silanu i pokrywania ujemnych form przez >14 godzin.

mPADS

Materiały:

• Baza polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz (Dow, Midland, MI)
• Jednorazowe pipety transferowe z szeroką szyjką
• Szkiełka szklane 2" x 3"
• Szklany skryba
• N2

Metoda:

1. Wymieszaj PDMS 10:1 wagowo i odgazuj w próżni przez 1 godzinę, aby usunąć pęcherzyki.
2. koronkowe silanizowane formy negatywowe w "krzyż"
3. Pipetować PDMS do form negatywowych, tak aby elementy były całkowicie pokryte do grubości 1 mm.
4. Odczekaj 30 minut, aż pęcherzyki powietrza w PDMS wydostaną się na powierzchnię.
5. W czasie przestoju 30' odkurz szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22x22mm (nr 2) strumieniem N2.
6. Szkiełka z plazmą tlenową przepuszczają połówki na 1,5 minuty w celu oczyszczenia i aktywacji szkła
7. Wydmuchuj uwięzione na powierzchni pęcherzyki powietrza w PDMS za pomocą szybkiego podmuchu N2.
8. Delikatnie połóż krawędź szklanego szkiełka nakrywkowego na PDMS oczyszczoną plazmowo stroną skierowaną w stronę PDMS. Powoli opuść szkiełko tak, aby PDMS w pełni stykał się z całą powierzchnią szkła i unikał uwięzienia pęcherzyków powietrza pod szklanym szkiełkiem.
9. Umieść zmontowane formy w piecu konwekcyjnym w temperaturze 110 °C na 20 godzin, aby całkowicie się utwardziły.
10. Wyjmij foremki z piekarnika i pozwól im ostygnąć do RT.
11. Przytrzymaj szklane szkiełko jedną ręką na górze i powoli oderwij negatyw od formy ujemnej od dołu, aby zwolnić mPAD.
12. Sprawdź mPAD pod mikroskopem pod kątem zapadniętych słupków.
13. Ponownie silanizuj formę za pomocą plazmy i silanu co cztery odlewy. Ujemna żywotność formy dla dobrej replikacji wynosi około 6-20 odlewów.

Umieszczanie komórek na mPADS

Tłoczenie

Materiały:

• Stemple PDMS dla uCP (patrz Tien, J & Chen, C. S., w: Methods of Tissue Engineering, 2001, str. 113-120).
• Etanol (100% i 70%)
• Sterylizowana woda dejonizowana
• 50 ug/ml ludzkiej fibronektyny w sterylnej wodzie dejonizowanej (BD Biosciences)
• 5 ug/ml Roztwór DiI przefiltrowany membraną 0,2 μm (D-3886, sondy molekularne, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Góra Oliwna, NJ)
• 1X Fosforanowy roztwór buforowy.
• Szalka Petriego 100 mm x 25 mm (4)
• Szalka Petriego 150 mm x 25 mm (2)
• Folia aluminiowa
• N2
• pęseta
• Sterylny kaptur

Metoda:

1. Przycinanie nadmiaru PDMS z mPADów
2. Jeśli stempel PDMS był używany wcześniej, należy sonikować stemple w 100% etanolu przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczające białka.
3. W sterylnym kapturze trzymaj stempele po bokach pęsetą i wysusz N2 po zanurzeniu znaczków w świeżym 100% etanolu i sterylnej wodzie
4. Umieścić na szalce Petriego o średnicy 150 mm stroną roboczą do góry.
5. Podwielokrotne krople roztworu fibronektyny na każdym stemplu. Zacznij od rogów na każdym ze stempli, następnie krawędzi, a na końcu obszarów wewnętrznych. Początkowo powierzchnia stempla PDMS jest hydrofobowa, ale staje się hydrofilowa w miarę adsorpcji białka. Praca "na zewnątrz do wewnątrz" zmienia kąt zwilżania PDMS tak, że do pełnego pokrycia stempla potrzebna jest mniejsza objętość roztworu fibronektyny.
6. Pozostaw na 1 godzinę w kapturze w celu adsorpcji białka.
7. Umyj stemple wodą DI, wlewając naczynie i pozwalając, aby poziom wody podniósł się nad stemplami.
8. Pieczątki umyć na szalce Petriego o średnicy 100 mm wypełnionej wodą DI.
9. Usuń i osusz za pomocą N2.
10. Poddaj je działaniu ozonu mPADS przez 7 minut, aby aktywować powierzchnię do tłoczenia.
11. Pod maską stempluj mPADS, umieszczając krawędź stempla na mPAD i delikatnie opuszczając, aby uzyskać pełny kontakt. Lekko postukaj pęsetą w górną część stempla, aby upewnić się, że wszystkie obszary mają dobry kontakt, ale uważaj, aby nie zawalić słupków.
12. Ostrożnie usuń stemple pęsetą.
13. Zanurz mPADS w 100 mm szalce Petriego ze 100% etanolem na ~15 sekund. Nie dopuścić do odwilżenia mikroigieł podczas przenoszenia, szybko przenosząc je między naczyniami.
14. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z 70% etanolem na ~15 sekund.
15. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ~15 sekund.
16. Zanurz mPADS w drugiej szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ~15 sekund.
17. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 150 mm z wodą DI.
18. Zanurz mPADS na szalce Petriego o średnicy 150 mm w 100 ml roztworu DiI.
19. Przykryj folią aluminiową i moczyć przez 1 godzinę.
20. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ~15 sekund.
21. Zanurz mPADS na 150 mm szalce Petriego z 10 ml 2% Pluronics i 90 ml PBS, aby uzyskać całkowite stężenie 0,2% Pluronics.
22. Przykryj i moczyć przez 1 godzinę.
23. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ~15 sekund.
24. Zanurz mPADS w drugiej szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ~15 sekund.
25. Zanurz mPADS w trzeciej 100-milimetrowej szalce Petriego z PBS na ~15 sekund.

Siew

Materiały:

• Wybrana linia komórkowa
• Trypsyna-EDTA (0,25% trypsyna z EDTA•4Na, Gibco Cat. Nr 25200-056)
• Pożywka wzrostowa
• 1X Fosforanowy roztwór buforowy.

Metoda:

1. W sterylnym kapturze umieść mPADS na szalce Petriego o średnicy 100 mm i napełnij 17 ml pożywki.
2. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze, aby ogrzać się do 37°C
3. Zawieś komórki za pomocą trypsyny
4. Odsysaj kilkakrotnie, aby rozbić skupiska komórek.
5. Zawiesinę komórek pipetować na płytkę Petriego za pomocą mPADS. Dodaj komórki w taki sposób, aby pozostały pojedynczymi komórkami (bez kontaktów komórka-komórka) w czasie analizy. Dokładna liczba komórek do dodania zależy od typu komórki i zależy od obszaru rozprzestrzeniania się komórek i szybkości wzrostu.
6. Delikatnie rozproszyj komórki na szalce Petriego, powoli pipetując.
7. Umieść w inkubatorze na 2 godziny, aby komórki mogły się ustabilizować i przylgnąć do mikroigieł.
8. Sprawdź mPADS, aby zobaczyć, czy komórki się rozprzestrzeniły. Komórki będą wyglądać na spłaszczone i obejmować sześć lub więcej postów.
9. Jeśli komórki są rozproszone, przenieś mPADS na nową płytkę Petriego o średnicy 100 mm z 21 ml świeżej pożywki.
10. Tablety mPADS są gotowe do eksperymentu.

Barwienie i montaż mPADS

Mocowanie

Materiały:

• Dejonizowana
• Fiolka z paraformeldahydem (16%)
• 10X roztwór buforu fosforanowego.
• 1X Fosforanowy roztwór buforowy.

Metoda:

1. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 30 ml DI, 10 ml paraformeldahydu (cała fiolka) i 4,5 ml 10X PBS jako roztwór utrwalający.
2. Dodać ~25 ml roztworu utrwalającego do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
3. Delikatnie zanurz mPAD z komórkami w naczyniu utrwalającym i pozostaw do inkubacji na 20 minut.
4. Zanurz mPADS w naczyniu 100 mm za pomocą 1X PBS trzy razy.
5. Gotowy do barwienia immunologicznego i montażu.

Analiza sił komórkowych na mPADS

Obrazowanie konfokalne

Materiały:

• Mikroskop konfokalny
• Obiektyw 63X
• Kostki filtracyjne dla przeciwciał drugorzędowych
• Zielona kostka filtracyjna (rodamina) do obrazowania DiI mikroigieł.

Metoda:

1. Umieść mPADy na stole montażowym i znajdź pojedyncze komórki z ekspozycją 300 ms, bez binningu.
2. Wierzchołki obrazu mikroigieł dla GÓRNEGO OBRAZU.
3. Korzystając z odczytu z-control, przechwyć obraz mikroigieł dla DOLNEGO OBRAZU.
4. Wyobraź sobie wszelkie inne kanały, w których masz plamy (Hoechst, falloidyna itp.)

Analiza obrazu

Materiały:

• MATLAB z zestawem narzędzi do przetwarzania obrazu

Metoda:

1. Obracanie i rejestrowanie górnych i dolnych obrazów
2. Pomiar środków ciężkości w pozycji dolnej (nieodchylonej) i górnej (odchylonej)
3. Obliczanie przemieszczenia
4. Korzystając ze stałej sprężystości dla słupków (znanej, zależy od geometrii słupka), oblicz wektor siły na każdym słupku
5. Analiza błędów opiera się na zdolności do rozwiązywania sił i zależy od rozdzielczości obrazu i rozdzielczości wykrywania centroid
6. Ułóż dane zgodnie z własnymi potrzebami – np. wielkościami sił i/lub kierunkiem, jako przebieg czasu, wiele pomiarów w różnych warunkach itp.