Mikrofabrykowane detektory w postaci macierzy słupków (mPADs): podejście do izolowania sił mechanicznych

Podsumowanie

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób wytwarzania i wykorzystywania mikrofabrykowanych detektorów w postaci macierzy słupków (mPADs) do oceny modulacji kurczliwości komórkowej.

Streszczenie

W niniejszym filmie przedstawimy naszą metodę pomiaru sił trakcyjnych komórek z wykorzystaniem mikrofabrykowanej macierzy słupków. Siły trakcyjne są generowane poprzez oddziaływania miozyny z aktyną i odgrywają ważną rolę w fizjologii organizmu. Podczas rozwoju umożliwiają one komórkom przemieszczanie się z jednego miejsca w drugie w celu formowania wczesnych struktur tkankowych. Siły trakcyjne wspomagają procesy gojenia. Są one niezbędne do prawidłowego zamykania się ran lub migracji i pełzania leukocytów w organizmie. Te same siły mogą być szkodliwe dla zdrowia w przypadku przerzutów nowotworowych lub wzrostu naczyń krwionośnych w kierunku guza. Najczęstszą metodą badania komórek in vitro było stosowanie naczyń szklanych lub polistyrenowych. Jednak sztywność tych podłoży uniemożliwia fizyczny pomiar sił trakcyjnych komórek, a metod badawczych pozwalających na ich analizę jest stosunkowo niewiele. Nasze laboratorium opracowało technikę pozwalającą przełamać te ograniczenia. Metoda ta opiera się na pionowej macierzy elastycznych belek wspornikowych, których sztywność i skala rozmiarów są dobrane tak, aby pojedyncze komórki rozprzestrzeniały się na wielu belkach i w tym procesie powodowały ich ugięcie. Stosowane przez nas słupki mają 3 $\mu$m średnicy, 10 $\mu$m wysokości i są ułożone w regularną macierz z rozstawem 9 $\mu$m między środkami. Wymiary fizyczne te można jednak łatwo zmieniać, aby dostosować je do różnych celów badawczych. Proces rozpoczynamy od wykonania matrycy krzemowej, lecz końcowe słupki są wykonane z gumy silikonowej zwanej poli(dimetylosiloksanem), czyli PDMS. Możemy mierzyć ugięcia pod mikroskopem i obliczać wartość oraz kierunek sił trakcyjnych niezbędnych do wywołania zaobserwowanych ugięć. Podłoża te nazywamy mikrofabrykowanymi detektorami w postaci macierzy słupków (ang. microfabricated post-array-detectors), w skrócie mPAD. W niniejszym materiale pokażemy, jak fabrykujemy i wykorzystujemy mPAD do oceny modulacji kurczliwości komórkowej.

Protokół

Wytwarzanie krzemowej formy głównej

Litografia

Materiały:

• Wafle krzemowe 75 mm
• Negatywny fotorezyst SU-8 2 (Microchem, Boston, MA)
• N2

Metoda:

1. Odwodnić wafle Si w temperaturze 120 °C przez 2 godziny.
2. Poddać powierzchnię działaniu ozonu UV przez 7 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń organicznych.
3. Przedmuchać powierzchnię strumieniem N2 w celu usunięcia cząstek stałych.
4. Nanieść SU-8 2 tak, aby pokryło 70% powierzchni (~10 ml dla wafla 75 mm).
5. Wirować z prędkością 2000 rpm przez 20 sekund przy przyspieszeniu 300 rpm/s.
6. Umieścić wa....