Mikrofabrykowane detektory w postaci macierzy słupków (mPADs): podejście do izolowania sił mechanicznych

Podsumowanie

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób wytwarzania i wykorzystywania mikrofabrykowanych detektorów w postaci macierzy słupków (mPADs) do oceny modulacji kurczliwości komórkowej.

Streszczenie

W niniejszym filmie przedstawimy naszą metodę pomiaru sił trakcyjnych komórek z wykorzystaniem mikrofabrykowanej macierzy słupków. Siły trakcyjne są generowane poprzez oddziaływania miozyny z aktyną i odgrywają ważną rolę w fizjologii organizmu. Podczas rozwoju umożliwiają one komórkom przemieszczanie się z jednego miejsca w drugie w celu formowania wczesnych struktur tkankowych. Siły trakcyjne wspomagają procesy gojenia. Są one niezbędne do prawidłowego zamykania się ran lub migracji i pełzania leukocytów w organizmie. Te same siły mogą być szkodliwe dla zdrowia w przypadku przerzutów nowotworowych lub wzrostu naczyń krwionośnych w kierunku guza. Najczęstszą metodą badania komórek in vitro było stosowanie naczyń szklanych lub polistyrenowych. Jednak sztywność tych podłoży uniemożliwia fizyczny pomiar sił trakcyjnych komórek, a metod badawczych pozwalających na ich analizę jest stosunkowo niewiele. Nasze laboratorium opracowało technikę pozwalającą przełamać te ograniczenia. Metoda ta opiera się na pionowej macierzy elastycznych belek wspornikowych, których sztywność i skala rozmiarów są dobrane tak, aby pojedyncze komórki rozprzestrzeniały się na wielu belkach i w tym procesie powodowały ich ugięcie. Stosowane przez nas słupki mają 3 $\mu$m średnicy, 10 $\mu$m wysokości i są ułożone w regularną macierz z rozstawem 9 $\mu$m między środkami. Wymiary fizyczne te można jednak łatwo zmieniać, aby dostosować je do różnych celów badawczych. Proces rozpoczynamy od wykonania matrycy krzemowej, lecz końcowe słupki są wykonane z gumy silikonowej zwanej poli(dimetylosiloksanem), czyli PDMS. Możemy mierzyć ugięcia pod mikroskopem i obliczać wartość oraz kierunek sił trakcyjnych niezbędnych do wywołania zaobserwowanych ugięć. Podłoża te nazywamy mikrofabrykowanymi detektorami w postaci macierzy słupków (ang. microfabricated post-array-detectors), w skrócie mPAD. W niniejszym materiale pokażemy, jak fabrykujemy i wykorzystujemy mPAD do oceny modulacji kurczliwości komórkowej.

Protokół

Wytwarzanie krzemowej formy głównej

Litografia

Materiały:

• Wafle krzemowe 75 mm
• Negatywny fotorezyst SU-8 2 (Microchem, Boston, MA)
• N2

Metoda:

1. Odwodnić wafle Si w temperaturze 120 °C przez 2 godziny.
2. Poddać powierzchnię działaniu ozonu UV przez 7 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń organicznych.
3. Przedmuchać powierzchnię strumieniem N2 w celu usunięcia cząstek stałych.
4. Nanieść SU-8 2 tak, aby pokryło 70% powierzchni (~10 ml dla wafla 75 mm).
5. Wirować z prędkością 2000 rpm przez 20 sekund przy przyspieszeniu 300 rpm/s.
6. Umieścić wafel na płycie grzejnej i stopniowo zwiększać temperaturę od temperatury pokojowej do 95 °C.
7. Przeprowadzić wstępne wygrzewanie (softbake) fotorezystu przez 15 minut w temperaturze 95 °C.
8. Naświetlić wafel całościowo dawką 20 - 25 mJ/cm2 przy 365 nm (I-line), aby uformować warstwę dolną.
9. Nanieść SU-8 2 w celu utworzenia drugiej warstwy fotorezystu.
10. Wirować z prędkością 550 rpm przez 20 sekund przy przyspieszeniu 300 rpm/s, aby uzyskać film o grubości około 11 μm.
11. Umieścić wafel na płycie grzejnej i stopniowo zwiększać temperaturę od temperatury pokojowej do 65 °C.
12. Przeprowadzić wstępne wygrzewanie (softbake) wafla w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
13. Stopniowo zwiększyć temperaturę płyty grzejnej z 65 °C do 95 °C.
14. Przeprowadzić wstępne wygrzewanie (softbake) wafla przez 55 minut w temperaturze 95 °C.
15. Studzić wafel do temperatury pokojowej przez 20 minut.
16. Ustawić maskę mPAD na waflu i naświetlić dawką 95 - 100 mJ/cm2 przy 365 nm (I-line).
17. Umieścić wafel na płycie grzejnej i stopniowo zwiększać temperaturę od temperatury pokojowej do 95 °C.
18. Przeprowadzić wygrzewanie po naświetlaniu (post-exposure bake) fotorezystu przez 25 minut w temperaturze 95 °C.

Opracowanie

Materiały:

• szalki szklane 100mm (5)
• Octan metylu eteru glikolu propylenowego (PGMEA)
• Izopropanol (IPA)
• N2

Metoda:

1. W dygestorium napełnić pięć naczyń odpowiednio: PGMEA (2), IPA oraz heksanem (2).
2. Zanurzyć wafelek w pierwszym naczyniu z PGMEA na 10 sekund.
3. Mieszać wafelek przez 50 sekund.
4. Przenieść wafelek do drugiego naczynia z PGMEA, zachowując menisk PGMEA.
5. Mieszać przez 5 sekund.
6. Przenieść wafelek do IPA, zachowując menisk PGMEA.
7. Mieszać przez 20 sekund.
8. Przenieść wafelek do pierwszego naczynia z IPA.
9. Mieszać przez 5 sekund.
10. Przenieść wafelek do drugiego naczynia z IPA.
11. Mieszać przez 5 sekund.
12. Szybko wyjąć wafelek z drugiego naczynia z IPA, zachowując menisk IPA, a następnie osuszyć strumieniem N2.
13. Obejrzeć wzór.
14. Wygrzać wafelek (hardbake) w temperaturze 120 °C przez 14-20 godzin w celu sieciowania SU-8.
15. Podzielić wafelek na mniejsze części za pomocą przecinarki diamentowej.
16. Zamocować wafelek na szkiełku przedmiotowym za pomocą epoksydu.
17. Przeprowadzić fluorosylanizację wafelka (patrz: instrukcje w sekcji dotyczące odlewania replikacyjnego).

Odlewanie replikacyjne mPADS

Forma negatywowa

Materiały:

• Jednorazowa aluminiowa łódka wagowa
• Baza i czynnik sieciujący polidimetylosiloksanu (PDMS) (Dow, Midland, MI)
• Żyletka
• Silan: (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan
• Laseczka szklana
• Szklana pipeta Pasteura

Metoda:

1. Wymieszać PDMS w stosunku wagowym 10:1 i odgazować w próżni przez 1 godzinę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
2. Umieścić krzemową formę matrycową w aluminiowej łódzce.
3. Wylać 50 – 60 g PDMS na formę matrycową w aluminiowej łódzce.
4. Odgazować w próżni przez 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
5. Usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione na powierzchni PDMS za pomocą krótkiego podmuchu N2.
6. Umieścić łódzkę w piecu konwekcyjnym w temperaturze 110 °C na 15 minut, aż PDMS stężeje.
7. Wyciąć aluminiową łódzkę.
8. Za pomocą żyletki odciąć nadmiar PDMS znajdujący się pod krzemową matrycą.
9. Powoli i jednostajnym ruchem w jednym kierunku oddzielić PDMS od krzemowej matrycy, aby uniknąć jej uszkodzenia.
10. Sprawdzić, czy krzemowa matryca nie została uszkodzona.
11. Podzielić formę negatywową na 4 części.
12. Powtórzyć kroki 1-10 dla dużej partii form negatywowych.
13. Poddać formę negatywową działaniu plazmy tlenowej przez 1,5 minuty w celu aktywacji powierzchni lub
14. Poddać formę negatywową działaniu ozonu przez 10 minut w celu aktywacji powierzchni.
15. Umieścić formy negatywowe w eksykatorze z odsłoniętymi strukturami mPAD.
16. Nanieść 250-500 μL silanu na szkiełko przedmiotowe w centrum eksykatora.
17. Umieścić w eksykatorze szklaną pipetę Pasteura z 150-200 μL silanu w końcówce.
18. Zastosować próżnię w komorze, aby odparować silan i pokryć formy negatywowe przez >14 godzin.

mPADS

Materiały:

• Baza i utwardzacz polidimetylosiloksanu (PDMS) (Dow, Midland, MI)
• Jednorazowe pipety transferowe z szerokim wlotem
• Przedmioty szkiełka podstawowe 2” x 3”
• Rylec do szkła
• N2

Metoda:

1. Wymieszać PDMS w stosunku 10:1 wagowo i odgazować w próżni przez 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
2. Umieścić zylanyzowane formy negatywowe w uchwycie krzyżowym.
3. Napipetować PDMS do form negatywowych tak, aby struktury były całkowicie pokryte warstwą o grubości 1mm.
4. Odczekać 30 minut, aż pęcherzyki powietrza w PDMS wypłyną na powierzchnię.
5. W czasie 30-minutowej przerwy oczyścić szklane laminki 22x22mm (nr 2) strumieniem N2.
6. Poddać połowy szkiełek szklanych działaniu plazmy tlenowej przez 1,5 minuty w celu oczyszczenia i aktywacji szkła.
7. Usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione na powierzchni PDMS za pomocą krótkiego podmuchu N2.
8. Ostrożnie położyć krawędź laminki szklanej na PDMS stroną oczyszczoną plazmą w stronę PDMS. Powoli opuścić szkiełko szklane tak, aby PDMS w pełni stykał się z całą powierzchnią szkła, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem.
9. Umieścić zmontowane formy w piecu konwekcyjnym w temperaturze 110 °C na 20 godzin do pełnego utwardzenia.
10. Wyjąć formy z pieca i pozostawić do ostygnięcia do RT.
11. Przytrzymać szkiełko szklane jedną ręką od góry i powoli odkleić formę negatywową od dołu, aby uwolnić mPAD.
12. Obejrzeć mPAD pod mikroskopem w celu sprawdzenia, czy nie doszło do zapadnięcia się słupków.
13. Ponownie zylanyzować formę za pomocą plazmy i silanu co cztery odlewy. Żywotność formy negatywowej zapewniająca dobrą replikację wynosi około 6-20 odlewów.

Wysiewanie komórek na mPADS

Stemplowanie

Materiały:

• Stemple PDMS do uCP (patrz Tien, J & Chen, C. S., w Methods of Tissue Engineering, 2001, s. 113-120.)
• Etanol (100% i 70%)
• Sterylna woda dejonizowana
• 50 ug/ml ludzkiej fibronektyny w sterylnej wodzie dejonizowanej (BD Biosciences)
• 5 ug/ml roztwór DiI przefiltrowany przez membranę 0.2 μm (D-3886, Molecular Probes, OR)
• 2% Pluronic F127 (BASF, Mount Olive, NJ)
• 1X roztwór buforu fosforanowego
• Szalki Petriego 100 mm x 25 mm (4)
• Szalki Petriego 150 mm x 25 mm (2)
• Folia aluminiowa
• N2
• Pinceta
• Dygestorium sterylne

Metoda:

1. Odetnij nadmiar PDMS z mPADs.
2. Jeśli stempel z PDMS był używany wcześniej, poddaj go sonikacji w 100% etanolu przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczające białka.
3. W komorze sterylnej przytrzymaj stemple bokiem za pomocą pęsety i osusz strumieniem N2 po zanurzeniu ich w świeżym 100% etanolu oraz sterylnej wodzie.
4. Umieść stemple w szalce Petriego o średnicy 150 mm stroną roboczą do góry.
5. Nanieś krople roztworu fibronektyny na każdy stempel. Zacznij od narożników każdego stempla, następnie krawędzi, a na końcu obszarów wewnętrznych. Początkowo powierzchnia PDMS stempla jest hydrofobowa, lecz staje się hydrofilowa w miarę adsorpcji białka. Praca od „zewnętrza do wnętrza” zmienia kąt zwilżania PDMS, dzięki czemu do pełnego pokrycia stempla potrzebna jest mniejsza objętość roztworu fibronektyny.
6. Pozostaw stemple w komorze przez 1 godzinę w celu adsorpcji białka.
7. Przemyj stemple wodą DI, wlewając ją do szalki i pozwalając, aby poziom wody przykrył stemple.
8. Przemyj stemple w szalce Petriego o średnicy 100 mm wypełnionej wodą DI.
9. Wyjmij i osusz strumieniem N2.
10. Poddaj mPADS działaniu ozonu przez 7 minut, aby aktywować powierzchnię do stemplowania.
11. W komorze stempluj mPADS, przykładając krawędź stempla do mPAD i delikatnie opuszczając go, aby zapewnić pełny kontakt. Lekko stuknij pęsetą w górną część stempla, aby upewnić się, że wszystkie obszary mają dobry kontakt, uważając jednocześnie, aby nie uszkodzić słupków.
12. Ostrożnie usuń stemple za pomocą pęsety.
13. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z 100% etanolem na ok. 15 sekund. Aby zapobiec odwilżaniu mikroigieł podczas przenoszenia, rób to szybko między szalkami.
14. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z 70% etanolem na ok. 15 sekund.
15. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ok. 15 sekund.
16. Zanurz mPADS w drugiej szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ok. 15 sekund.
17. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 150 mm z wodą DI.
18. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 150 mm z 100 mL roztworu DiI.
19. Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę.
20. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ok. 15 sekund.
21. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 150 mm z 10 mL 2% Pluronics i 90 mL PBS, aby uzyskać całkowite stężenie 0,2% Pluronics.
22. Przykryj i inkubuj przez 1 godzinę.
23. Zanurz mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ok. 15 sekund.
24. Zanurz mPADS w drugiej szalce Petriego o średnicy 100 mm z wodą DI na ok. 15 sekund.
25. Zanurz mPADS w trzeciej szalce Petriego o średnicy 100 mm z PBS na ok. 15 sekund.

Wysiewanie

Materiały:

• Wybrana linia komórkowa
• Trypsyna-EDTA (0,25% trypsyny z EDTA•4Na, Gibco kat. nr 25200-056)
• Pożywka wzrostowa
• 1X roztwór buforu fosforanowego.

Metoda:

1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieść mPADS w szalce Petriego o średnicy 100 mm i wypełnij ją 17 mL pożywki.
2. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze, aby ogrzała się do 37°C.
3. Zresuspenduj komórki za pomocą trypsyny.
4. Wielokrotnie aspiruj zawiesinę, aby rozbić skupiska komórek.
5. Pipetuj zawiesinę komórkową do szalki Petriego z mPADS. Dodaj taką liczbę komórek, aby w momencie analizy pozostały one pojedynczymi komórkami (bez kontaktów międzykomórkowych). Dokładna liczba dodawanych komórek jest specyficzna dla danego typu komórek i zależy od powierzchni rozprzestrzeniania się komórek oraz tempa ich wzrostu.
6. Delikatnie rozprowadź komórki w szalce Petriego, powoli pipetując zawiesinę.
7. Umieść szalkę w inkubatorze na 2 godziny, aby umożliwić komórkom osiadanie i przyleganie do mikroigieł.
8. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki na mPADS uległy rozprzestrzenieniu. Komórki powinny być spłaszczone i obejmować sześć lub więcej słupków.
9. Jeśli komórki się rozprzestrzeniły, przenieś mPADS do nowej szalki Petriego o średnicy 100 mm z 21 mL świeżej pożywki.
10. mPADS są gotowe do przeprowadzenia eksperymentu.

Barwienie i montowanie mPADS

Fiksacja

Materiały:

• Woda dejonizowana
• Fiolka z paraformaldehydem (16%)
• 10X roztwór buforu fosforanowego
• 1X roztwór buforu fosforanowego

Metoda:

1. W probówce wirówkowej o pojemności 50mL przygotować roztwór utrwalający, dodając 30 mL wody DI, 10 mL paraformaldehydu (cała fiolka) oraz 4,5 mL 10X PBS.
2. Przenieść ok. 25 mL roztworu utrwalającego do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
3. Ostrożnie zanurzyć mPAD z komórkami w szalce z utrwalaczem i inkubować przez 20 minut.
4. Trzykrotnie przemyć mPADS, zanurzając je w szalce 100 mm z 1X PBS.
5. Próbki są gotowe do immunobarwienia i montażu.

Analiza sił komórkowych na mPADS

Obrazowanie konfokalne

Materiały:

• Mikroskop konfokalny
• Obiektyw 63X
• Kostki filtracyjne do przeciwciał wtórnych
• Zielona kostka filtracyjna (Rhodamine) do obrazowania mikroigieł DiI.

Metoda:

1. Umieść mPADy na stoliku i odnajdź pojedyncze komórki, stosując czas naświetlania 300 ms bez binningu.
2. Wykonaj zdjęcia wierzchołków mikroiłeczek w celu uzyskania OBRAZU GÓRNEGO (TOP IMAGE).
3. Korzystając z odczytu kontroli osi z, wykonaj zdjęcie mikroiłeczek w celu uzyskania OBRAZU DOLNEGO (BOTTOM IMAGE).
4. Wykonaj zdjęcia w pozostałych kanałach, w których zastosowano barwienia (Hoechst, falloidyna itd.).

Analiza obrazu

Materiały:

• MATLAB z Image Processing Toolbox

Metoda:

1. Obróć i zarejestruj obrazy górny oraz dolny
2. Zmierz centroidy pozycji dolnej (niedodatkowej) i górnej (odkształconej)
3. Oblicz przemieszczenie
4. Wykorzystując stałą sprężystości słupków (znaną, zależną od geometrii słupka), oblicz wektor siły dla każdego słupka
5. Analiza błędów opiera się na zdolności do rozdzielczości sił i zależy od rozdzielczości obrazu oraz rozdzielczości detekcji centroidu
6. Uporządkuj dane zgodnie z własnymi potrzebami – np. wartości siły i/lub kierunek, jako przebieg czasowy, wiele pomiarów w różnych warunkach itp.