$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie materiałów wymaganych do hodowli iPSC i różnicowania BEC.
- Powlekanie matrycą z tworzywa sztucznego z hodowli tkankowej (TC) do hodowli iPSC IMR90-4
- Podwielokrotność żelu z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel) w podwielokrotnościach 2,5 mg i przechowywać w temperaturze -20 °C.
nuta: Podczas pracy z matrycą żelową i podwielokrotnością na lodzie należy pracować szybko, ponieważ tworzy on żel o temperaturze powyżej 4 °C i nie można go porcjować po zestaleniu.
- W celu pokrycia tworzywa sztucznego TC należy szybko dodać jedną porcję żelu matrycowego do 30 ml pożywki Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 firmy Dulbecco w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 1 ml pożywki do zamrożonego żelu matrycowego, pipetować w górę i w dół, aż do rozmrożenia, a następnie natychmiast przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pozostałym podłożem.
- Użyć 1 ml tego roztworu do powlekania żelem matrycowym na zagłębienie płytki 6-dołkowej i 12 ml na kolbę T75.
nuta: Tworzywo sztuczne TC powlekane żelem Matrix można przygotować do dwóch tygodni przed użyciem. Bardzo ważne jest jednak, aby tego uniknąć, ponieważ roztwór żelu matrycowego wysycha, co może wymagać okazjonalnego dodawania większej ilości DMEM/F12 na wierzch studzienek.
- Przygotuj pożywkę do konserwacji komórek macierzystych, dodając 50 ml 50-krotnego suplementu do 450 ml podstawowej pożywki do utrzymania komórek macierzystych w sterylnym środowisku komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Aby przygotować 500 ml bezkondycjonowanej pożywki (UM), połącz 392,5 ml DMEM/F12 ze 100 ml zastępczej surowicy nokautującej (KOSR), 5 ml aminokwasów endogennych, L-glutaminą w końcowym stężeniu 1 mM i 3,5 μl β-merkaptoetanolu. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
- Aby przygotować 200 ml pożywki z komórek śródbłonka (EC) plus kwas retinowy (RA) plus bFGF, połącz 198 ml wolnej pożywki ludzkiej surowicy śródbłonka (hESFM), 2 ml sterylizowanej filtrem surowicy ubogiej w płytki krwi (PDS) i 20 ng/ml bFGF. Filtrować, sterylizować i przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C. Tuż przed dodaniem do komórek dodać 10 μM RA do pożywki EC.
nuta: Ponieważ PDS został wycofany i w związku z tym może być ograniczony, protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony przy użyciu B27 zamiast PDS.
- Aby przygotować 200 ml pożywki EC bez RA lub bFGF, połącz 198 ml hESFM i 2 ml PDS sterylizowanego filtrem i wysterylizuj filtrem. Przechowywać do 4 tygodni w temperaturze 4 °C.
2. Różnicowanie komórek śródbłonka mózgu od ludzkich iPSC
- Posiewanie iPSC w celu różnicowania (dzień -3 protokołu różnicowania)
- Na dobrze przystosowaną do hodowli podtrzymującej IMR90-4 do płytki w celu różnicowania, odessać pożywkę hodowlaną, dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
- Dezaktywować enzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek, przenosząc 1 ml zawiesiny zdysocjowanych komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z co najmniej 2 ml świeżej pożywki podtrzymującej komórki macierzyste na 1 ml komórek. Obracać zawiesinę komórek w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut.
- Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki podtrzymującej komórki macierzyste na studzienkę użytych komórek IMR90-4 i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
nuta: Pomocne może być rozcieńczenie 1:1 0,4% błękitu trypanowego, aby odróżnić żywe i martwe komórki podczas liczenia. W zależności od gęstości iPSC, z jednej studzienki na płytce 6-dołkowej zwykle uzyskuje się 1–10x 6 komórek.
- W celu różnicowania w kolbie T75 dodać 7,5 x 105 komórek do 12 ml pożywki podtrzymującej komórki macierzyste i inhibitora ROCK (dichlorowodorku Y27632) o końcowym stężeniu 10 μM. Odessać roztwór żelu do powlekania matrycą z kolby T75 i przenieść zawiesinę komórek do kolby. Rozprowadzić komórki równomiernie, potrząsając kolbą w przód i w tył, od lewej do prawej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
nuta: Na tym etapie bardzo ważne jest dodanie inhibitora ROCK, aby zwiększyć przeżywalność zdysocjowanych pojedynczych komórek macierzystych. Komórki powinny być równomiernie rozmieszczone w kolbie i w podkoszulkach wykazujących rozsianą, mezenchymalną morfologię spowodowaną podaniem inhibitora ROCK.
- W dniu -2 i w dniu -1 zmień pożywkę na świeżą pożywkę podtrzymującą komórki macierzyste; 12 ml na T75.
- W dniu 0 rozpocznij różnicowanie, zmieniając pożywkę na UM; 12 ml na T75.
- Zmieniaj UM codziennie (dzień 1 – dzień 5).
nuta: Komórki zazwyczaj osiągają konfluencję po 2 do 3 dniach w UM, co można zaobserwować gołym okiem lub pod mikroskopem odwróconego jasnego pola. W miarę postępu różnicowania "drogi nerwowe" nestin+ stają się widoczne z komórkami PECAM-1+ pomiędzy nimi.
- Selektywnie rozszerzaj populację komórek śródbłonka, przechodząc na pożywkę EC z 20 ng/ml bFGF i 10 μM kwasu retinowego (RA) (dzień 6) i inkubując przez dwa dni. Pożywkę EC z bFGF można przygotować do dwóch tygodni wcześniej. RA dodaje się z zamrożonego wywaru w dniu użycia (np. 1 μl 10 mM RA na 1 ml EC + bFGF).
nuta: Skuteczne różnicowanie można również osiągnąć bez suplementacji RZS w 6. i 8. dniu. Pominięcie RA spowoduje jednak powstanie BEC o obniżonym TEER.
- Pokryj płytki do hodowli komórkowych i wkładki błonowe (np. Transwell) kolagenem dożylnym i fibronektyną (dzień 7), w celu oczyszczenia BEC i przeprowadzenia eksperymentów.
- Aby pokryć wkładki membranowe, połącz 4 części kolagenu IV (1 mg / ml w 0,5 mg / ml kwasu octowego), 1 część fibronektyny (1 mg / ml) i 5 części sterylnej wody tkankowej. Roztwór ECM można rozcieńczyć w stosunku 1:5 w celu pokrycia płytek do hodowli komórkowych (tj. 4 części kolagenu dożylnego, 1 część fibronektyny, 45 części wody). Inkubować z roztworem powlekającym w temperaturze 37 °C przez noc.
UWAGA: Płytki i wkładki membranowe mogą być również powlekane przez co najmniej 4 godziny przed subkulturacją w tym samym dniu etapu oczyszczania.
- Oczyść BEC poprzez subkulturację zróżnicowanych komórek na płytkach pokrytych kolagenem IV i fibronektyną lub wkładkach błonowych (dzień 8).
- Odessać pożywkę EC i dodać odczynnik enzymatyczny do dysocjacji komórek (12 ml na T75). Inkubować w temperaturze 37 °C aż do momentu, gdy 90% komórek oderwie się od kolby.
nuta: Dysocjacja komórek może trwać do 1 godziny.
- W czasie inkubacji należy usunąć roztwór powlekający kolagen IV/fibronektynę z wcześniej przygotowanych płytek/wkładek i pozostawić do wyschnięcia w sterylnym kapturze. Wyschnięcie wkładek zajmuje około 20 minut.
- Po oderwaniu się komórek zmyć je z kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
nuta: Zawiesina pojedynczej komórki jest ważna dla niezawodnego zliczania komórek i uzyskania stałych monowarstw.
- Rozcieńczyć co najmniej równą objętością świeżego hESFM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
- Granulować komórki w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut.
- Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości świeżo przygotowanego EC + bFGF + RA, aby uzyskać zawiesinę 2 x 106 komórek/ml do wysiewu na wkładkach membranowych. Dodaj 500 μl (1 x 106 komórek) na wierzch 12-dołkowej wkładki i 1,5 ml pożywki EC + bFGF + RA na dnie. W przypadku wysiewu na płytkach 24- i 48-dołkowych należy rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:2 i dodać odpowiednio 500 μl (5 x 105 komórek) i 250 μl (2,5 x 105 komórek) na dołek. Rozmieścić komórki równomiernie w basenie/wkładce i inkubować w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
- Zmień pożywki na płytkach/transwellach na EC bez bFGF lub RA (dzień 9).