Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Izolacja frakcji zrębowej (SVF)
Zbierz tkankę tłuszczową łuku okołoaortalnego (PAAT) 5-6 myszy do jednej probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do trawienia i zmiel tkankę za pomocą nożyczek chirurgicznych w probówce Eppendorfa w temperaturze pokojowej (RT).
- Przenieść mieszaninę do probówek o pojemności 50 ml zawierających 9 ml pożywki wytrawiającej. Homogenizować tkanki, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety 1 ml 10x.
- Inkubować probówki w temperaturze 37 °C, stale wstrząsając przy 100 obr./min przez 30–45 minut i sprawdzać co 5–10 minut, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Ma to kluczowe znaczenie dla poprawy żywotności i wydajności komórek.
nuta: Dobre trawienie tkankowe spowoduje powstanie jednorodnej, jasnożółtej tkanki tłuszczowej, która jest widoczna gołym okiem po delikatnym zawirowaniu rurki.
- Zatrzymać trawienie, dodając 5 ml HDMEM zawierającego 10% FBS i 1% v/v PS w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać pipetując.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. SVF będzie widoczny jako brązowawa granulka. Ostrożnie odessać pływające adipocyty i zdekantować pozostały supernatant bez naruszania SVF. Rozpuścić osad SVF w 10 ml pożywki hodowlanej i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 5 ml buforu do lizy erytrocytów w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zatrzymaj reakcję, dodając 10 ml 1x PBS zawierającego 1% FBS. Odwirować zawiesinę komórek o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml 1 x PBS zawierającego 1% FBS.
- Ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C.
- Po ostatniej rundzie wirowania (500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), ponownie zawiesić granulowane komórki w 5 ml buforu FACS (PBS zawierający 10% FBS, 100 jednostek/mL DNA I 1% v/v PS) na lodzie i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
2. Izolacja NCADSC przez FACS
- Skonfiguruj i zoptymalizuj sortownik komórek zgodnie z instrukcją obsługi. Wybierz dyszę 100 μm, wysterylizuj probówki zbiorcze, zainstaluj wymagane urządzenie zbierające i ustaw strumienie boczne.
- Do sortowania komórek RFP+ zalecany jest żółto-zielony laser 561 nm i filtr optyczny 579/16. Przeprowadzić kompensację przy użyciu kontroli ujemnej i jednobarwnych kontroli dodatnich. Patrz rysunek 1A, aby zapoznać się ze schematem bramkowania.
- Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm, odwirować przy 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w 2 ml buforu FACS o gęstości 0,5–1 x 107/ml. Przenieś komórki do wyraźnie oznaczonych okrągłodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml i załaduj je do sortera.
- Uruchomić probówkę z próbką eksperymentalną w temperaturze 4 °C, włączyć płytki odchylające i posortować do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wstępnie pokrytej RPMI zawierającej 1% FBS i 1% v/v PS.
nuta: Chroń próbki przed silnym światłem, aby zminimalizować wygaszanie RFP.
3. Kultura NCADSC
- Posortowane komórki należy rozłożyć na płytkach o gęstości 5 000 komórek/cm2 na 12-dołkowej płytce hodowlanej w kompletnej pożywce i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 20–24 godziny.
- Usunąć pożywkę hodowlaną, umyć komórki wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS w celu usunięcia resztek komórek i dodać świeżą pożywkę hodowlaną.
