Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie sterylnych roztworów poli-D-lizyny (PDL) i lamininy
- Co najmniej jeden dzień przed izolacją komórek należy przygotować płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL) i lamininą.
nuta: W zależności od celów eksperymentu przygotowano zarówno płytki 6-dołkowe, jak i 12-dołkowe. Zazwyczaj do analizy ilościowej przy użyciu zachodnich plam używano płytek 12-dołkowych, podczas gdy płytki 6-dołkowe używano do przechowywania autoklawowanych (sterylnych) szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii. Płytki 24-dołkowe wykorzystano do hodowli komórek glejowych jelitowych (EGC) do obrazowania strumienia Ca2+.
- Rozcieńczyć roztwory podstawowe ultraczystą wodą klasy kultur tkankowych, wolną od DNaz i RNaz w kapturze do hodowli tkankowych z powietrzem przefiltrowanym przez HEPA.
- Sterylizacja szkiełek nakrywkowych
- Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe sterylnymi kleszkami i zanurz szkiełka nakrywkowe w zlewce ze 100% etanolem na 15 minut. Poczekaj, aż etanol odparuje w kapturze do hodowli tkankowych, a następnie umieść go w płytkach 6-dołkowych.
- Alternatywnie umieść kilka szkiełek nakrywkowych pojedynczo na bibule o grubości 2 mm w plastikowym pojemniku, a następnie w autoklawie.
2. Płyty do powlekania
UWAGA: Wykonaj te kroki pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
- Rozmrozić 1 mg/ml PDL i rozcieńczyć w stosunku 1:10 sterylną wodą do hodowli tkankowych, tak aby końcowe stężenie wynosiło 100 μg/ml. Użyj 2 ml na dołek do pokrycia płytek 6-dołkowych, 1 ml do przykrycia jednego dołka płytki 12-dołkowej i 0,5 ml na jeden dołek w płytkach 24-dołkowych. Pozostałą rozcieńczoną cząstkę PDL należy przechowywać w 12 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
- Po pozostawieniu PDL do pokrycia studzienek przez co najmniej 1 godzinę, należy usunąć PDL za pomocą sterylnej pipety. Pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia na powietrzu pod okapem z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych.
nuta: Po usunięciu roztworu PDL za pomocą sterylnej pipety, można go użyć jeszcze dwukrotnie w ciągu 1 tygodnia po przejściu przez filtr 0,22 μm i przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
- Rozmrozić wywar z lamininy na lodzie, aby uniknąć tworzenia się żelu.
nuta: Nierozcieńczona laminina staje się stała po ogrzaniu powyżej 8 °C.
- Rozcieńczyć lamininę (0,5 mg/ml) w stosunku 1:50 sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml. Rozcieńczoną lamininę przechowywać w 12 ml porcji w temperaturze -20 °C.
- Dodaj rozcieńczoną lamininę do studzienek zawierających wysuszony PDL. Użyj 1 ml do przykrycia powierzchni 6-dołkowej i 0,5 ml do przykrycia dna płytek 12-dołkowych. W przypadku szkiełek nakrywkowych dodaj 400 μl rozcieńczonej lamininy do szkiełek nakrywkowych, aby uzyskać pokrycie powierzchni.
- Inkubować powlekane płytki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, jeśli płytka jest używana tego samego dnia (szybkie powlekanie). Jeśli nie, zamknij płytki folią spożywczą i przechowuj je przez noc w temperaturze 4 °C (powolne powlekanie).
nuta: Uszczelnienie ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć wysuszenia i zanieczyszczenia.
- Ostrożnie usuń roztwór lamininy pipetą, aby uniknąć zarysowania powierzchni. Delikatnie umyj studzienki trzykrotnie sterylnym DPBS.
- Dodać kompletną pożywkę do wzrostu gleju do każdej studzienki i utrzymywać płytki w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do dodania zawiesiny EGC.
nuta: Płytki pokryte poli-D, lizyną i lamininą można przechowywać przez 3 dni w temperaturze 4 °C. Płytki należy pokryć kilka dni wcześniej, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C; Umyj płytki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco trzy razy. Dodaj 2 ml sterylnego DPBS do każdego dołka po ostatnim myciu. Uszczelnić płytkę parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Istotne jest, aby laminina nie wysychała.
3. Przygotowanie roztworów izolacyjnych
- Przygotować roztwór dysocjacyjny EDTA/HEPES/DPBS. Na 500 ml roztworu użyj sterylnego DPBS (bez wapnia i magnezu), aby uzyskać końcowy roztwór 10 mM HEPES i 5 mM EDTA. Do 490 ml DPBS dodać 5 ml 1 M buforu HEPES i 5 ml 0,5 M roztworu podstawowego EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotować pożywkę do zawieszania komórek glejowych przy użyciu odczynników wymienionych w Tabeli 1.
- Przygotować pożywkę glejową przy użyciu odczynników wymienionych w tabeli 2.
nuta: Pożywki glejowe zawierające GDNF mogą być przechowywane przez tydzień w temperaturze 4 °C.
4. Usunięcie odcinka jelitowego
UWAGA: Myszom pozwolono na swobodny dostęp do jedzenia i wody przed eutanazją metodą kropli izofluranu i usunięciem ważnego organu. Użyto myszy C57BL/6 w wieku powyżej 8 tygodni. Obie płcie stosowano bez zauważalnych różnic w preparacie.
- Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu i umieść ją na wznak na tacy sekcyjnej. Przypnij kończyny i wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Zabezpiecz skórę kleszczami, a następnie otwórz brzuch nożyczkami.
- Podnieś wątrobę i zidentyfikuj dystalną część żołądka/odźwiernika. Następnie usuń 7 cm proksymalnego jelita. Uważaj, aby nie rozerwać jelita.
- Przytrzymaj odźwiernik kleszczami, jednocześnie odcinając krezkę.
- Użyj rozwarstwienia grzbietem nożyczek, aby zeskrobać przylegającą trzustkę.
- Umieść segment jelita w lodowatym DPBS bez Ca2+ lub Mg2+ (ryc. 1A).
nuta: Inne segmenty jelita grubego lub okrężnicy można również usunąć przy użyciu tej samej techniki.
- Użyj strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml przymocowanej do igły o wadze 20 g, aby wypłukać zawartość kału za pomocą lodowatego DPBS (ryc. 1B).
- Podziel jelito na 3 cm segmenty, aby usunąć mięsień podłużny. UWAGA: Segmenty jelitowe od maksymalnie dwóch myszy stosuje się na 30 ml roztworu izolacyjnego HEPES/EDTA/DPBS.
- Odłam około 4 cm, aby oddzielić drewniany patyczek od bawełnianej końcówki. Namocz drewniany patyczek w DPBS (Rysunek 1C).
- Delikatnie wsuń jeden z segmentów jelita na zwilżony patyczek (ryc. 2A-C).
- Usuń przylegającą krezkę, która jest nadal przyczepiona, za pomocą kleszczy igłowych (Rysunek 2D).
- Użyj czystej żyletki lub skalpela, aby wykonać dwa podłużne nacięcia wzdłuż jelita, do którego przyczepiono krezkę (ryc. 2E).
- Zwilż bawełnianą końcówkę DPBS. Pocieraj zwilżoną bawełnianą końcówkę wzdłuż mięśnia, aby rozluźnić mięsień podłużny/splot mięśniowo-jelitowy (LMMP). Następnie przesuń bawełnianą końcówkę poziomo, aby oderwać LMMP od mięśnia okrężnego wzdłuż odcinka jelita podczas usuwania LMMP.
- Przytrzymaj czubek patyczka między kciukiem a palcem wskazującym, jednocześnie stabilizując segment środkowym i czwartym palcem (Rysunek 2F). Po zakończeniu LMMP z łatwością odklei odcinek jelitowy.
- Wyrzuć LMMP usunięty z rurki jelitowej i przymocowany do bawełnianego wacika, chyba że pożądane jest pobranie EGC ze splotu mięśniowo-jelitowego.
- Użyj żyletki, aby otworzyć segment jelita wzdłużnie, aby usunąć go z drewnianego patyczka.
- Pozbawioną tkanki jelitową (głównie błonę śluzową i podśluzówkę oraz mięsień okrężny) należy przechowywać w DPBS na lodzie. Powtarzaj kroki 4.4–4.11, aż wszystkie segmenty jelita zostaną przygotowane.
5. Usunięcie błony śluzowej nabłonka
- Pokrój jelita na mniejsze kawałki o długości ~0,5 cm cienkimi nożyczkami.
- Umieść tkankę w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml lodowatego roztworu EDTA/HEPES/DPBS.
- Kołysz roztwór zawierający tkankę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy ~60 nachyleniach na minutę.
- Wstępnie zwilżyć plastikową pipetę o pojemności 5 ml, pipetując raz bufor EDTA/HEPES/DPBS w górę iw dół, a następnie użyć wstępnie zwilżonej pipety do pipetowania tkanki i zawiesiny buforowej w górę iw dół (rozcieranie) 20 razy, aby usunąć błonę śluzową nabłonka.
- Zebrać tkankę z inkubacji EDTA, przelewając mieszaninę przez sitko do komórek nylonowych o wielkości 100 μm. Odrzuć mętny, wypełniony śluzem przepływ (ryc. 3).
- Umieść tkankę zatrzymaną w sitku w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml lodowatego EDTA/HEPES/DPBS za pomocą kleszczy igłowych.
- Powtórzyć inkubację EDTA/HEPES/DPBS po raz drugi, kołysząc tkanką w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy ~60 nachyleniach na minutę, aby usunąć dodatkową błonę śluzową nabłonka.
- Wstępnie zwilż pipetę o pojemności 5 ml buforem, a następnie odpipetuj zawiesinę tkankową 20 razy w górę i w dół, aby usunąć komórki śluzowe.
nuta: Tkanka będzie miała tendencję do przyklejania się do wnętrza pipety w miarę usuwania większej ilości nabłonka.
- Zebrać tkankę po drugiej inkubacji, przelewając mieszaninę przez sitko do komórek nylonowych o wielkości 100 μm i odrzucić przepływ. Drugi przepływ powinien być zauważalnie mniej mętny niż pierwszy (rysunek 3).
- Powtarzaj 10-minutowe inkubacje EDTA, aż roztwór będzie prawie klarowny (około 3 do 4 inkubacji w zależności od ilości tkanki i skuteczności rozcierania) (ryc. 3).
6. Pobieranie komórek glejowych jelitowych z blaszki właściwej i błony podśluzowej
- Przenieść tkankę z nylonowego sitka do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml dostępnego w handlu roztworu do odzyskiwania komórek i rozdrabniać przez 25–30 minut w temperaturze 4 °C.
- Delikatnie rozcieraj 10x, aby oddzielić komórki glejowe jelita od blaszki właściwej.
- Przefiltrować przez filtr 40 μm i zebrać filtrat do czystej probówki o pojemności 50 ml.
- Opłucz chusteczkę na nylonowym filtrze 1 ml DPBS.
- Wyrzuć tkankę i przenieś ~5–6 ml filtratu do czystej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Wirować filtrat o stężeniu 2 000 x g w wirówce z odchylanym kubełkiem przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Ponownie zawiesić osad zawierający komórki glejowe w co najmniej 1 ml buforu do sporządzania zawiesiny, delikatnie pipetując osad w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 500 μl. Unikaj wprowadzania bąbelków.
nuta: W razie potrzeby dostosuj objętość ponownego zawieszenia do liczby dołków i płytek. Na przykład 1,2 ml na jedną płytkę 6-dołkową, 2,4 ml na dwie płytki 6-dołkowe, 2,4 ml na jedną płytkę 12-dołkową.
- Odpipetować 200 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 6-dołkowego lub 100 μl w przypadku 12-dołkowych płytek pokrytych PDL-lamininą zawierających pożywkę do wzrostu gleju.
- Nie należy naruszać potraw po dodaniu komórek do płytek i umieszczeniu w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić przyleganie maksymalnej liczby komórek.
nuta: Zdrowy preparat komórek przyczepi się w ciągu 6–8 godzin, ale odczekaj co najmniej 24 godziny przed zmianą pożywki, delikatnie pipetując pożywkę wraz z nieprzylegającymi komórkami.
- Użyj komórek do eksperymentów 3-4 dni po umieszczeniu ich w hodowli (ryc. 4).
Tabela 1. Skład pożywki do zawieszania komórek glejowych.
| Składniki | Objętość, która ma zostać dodana | Stężenie końcowe |
| DMEM/F12 | 44,5 ml | _ |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | 5 ml | 10% |
| Penicylina-Streptomycyna | 500 μL | Wstrzykiwacz 100 j.m./ml |
| Streptomycyny | | 100 μg/ml paciorkowca |
| Gentamycyna (zapas 50 mg/ml) | 20 μL | 20 μg/ml |
Tabela 2. Skład pożywki do wzrostu komórek glejowych
| Składniki | Objętość, która ma zostać dodana | Stężenie końcowe |
| DMEM/F12 | 44 ml | _ |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | 5 ml | 10% |
| Penicylina-Streptomycyna (100x) | 500μL | 100 j.m./ml (długopis) |
| 100 μg/ml (paciorkowiec) | | |
| Gentamycyna (zapas 50 mg/ml) | 20 μL | 20 μg/ml |
| GDNF (zapas 10 μg/ml) | 50 μL | 10 ng/ml |
