Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Oczyszczanie naczyń włosowatych mózgu świni
- Zbierz 8-10 mózgów od 5-6 miesięcznych świń domowych (np. z pobliskiej rzeźni) i przetransportuj je na lodzie do laboratorium. Zalecamy rozpoczęcie następującej procedury oczyszczania w ciągu 2-3 godzin od uśmiercenia zwierzęcia.
- Umieść mózgi w sterylnej ławce przepływowej i delikatnie umyj je 1 litrem PBS w zlewce umieszczonej na lodzie.
- Ostrożnie usuwaj opony mózgowe z jednego mózgu na raz za pomocą kleszczy z cienką końcówką i przenieś mózgi wolne od opon mózgowych do innej zlewki o pojemności 1 l z PBS umieszczonym na lodzie. Wydłużenie czasu potrzebnego na usunięcie może skomplikować usunięcie. Przybliżony czas stosowany dla każdego mózgu powinien wynosić 10-15 minut.
- Za pomocą skalpela zeskrob istotę szarą z jednego mózgu na raz i przenieś wyizolowany materiał na szalki Petriego (8,8 cm2) zawierające 20 ml mieszanki składników odżywczych DMEM F-12 (DMEM/F-12) umieszczonej na lodzie. Wyizolować jak najwięcej istoty szarej bez wycofywania materiału istoty białej. W celu wstępnej fragmentacji przepuść materiał istoty szarej przez strzykawkę o pojemności 50 ml bez igły. Kontynuuj dla wszystkich mózgów i połącz zebrany materiał istoty szarej. Wydłużenie czasu potrzebnego na usunięcie może skomplikować usunięcie. Przybliżony czas stosowany dla każdego mózgu powinien wynosić 10-15 minut.
- Przenieś wyizolowany materiał istoty szarej do probówki rozdrabniacza ręcznego homogenizatora tkanek w stosunku 50/50 z pożywką DMEM/F-12. Homogenizuj materiał, wykonując 8 ruchów w górę iw dół luźnym tłuczkiem, a następnie 8 ruchów w górę iw dół ciasnym tłuczkiem. Kontynuuj, aż cały wyizolowany materiał zostanie zhomogenizowany, następnie przenieś homogenat do butelki o pojemności 500 ml i rozcieńcz DMEM/F-12 do około 450 ml całkowitej objętości.
- Przefiltruj homogenat za pomocą butelki z niebieską nakrętką o pojemności 500 ml z uchwytem filtra i siatką filtracyjną 140 μm, a następnie wyizoluj naczynia włosowate, przepuszczając tkankę przez filtr. Użyj jednego filtra na 50 ml homogenatu, a następnie umyj każdy filtr DMEM/F-12.
- Umieścić filtry kapilarne na szalkach Petriego z roztworem trawiącym trypsyny/EDTA (2,5 % trypsyny, 0,1 nM EDTA w PBS), kolagenazy CLS2 (2 000 U / ml) i DNazy 1 (3 400 U / ml) w DMEM/F-12. Użyj 1 szalki Petriego (8,8 cm2, 20 ml roztworu) na 3 oczka filtracyjne.
- Umieścić szalki Petriego w temperaturze 37 °C na 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min lub delikatnie mieszać je co 10 minut. Po 1 godzinie zmyć kapilary z filtrów zawiesiną z płytki Petriego za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
- Podziel zawiesinę z 3 szalek na 2 probówki o pojemności 50 ml i zatrzymaj trawienie, dodając 10 ml DMEM/F-12 do każdej probówki o pojemności 50 ml.
- Odwirować zawiesiny komórkowe w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 10 ml DMEM/F-12. Dodać kolejne 20 ml DMEM/F12 do każdej probówki. Powtórz ten krok wirówki dwukrotnie.
- Pozwól probówkom ostygnąć na lodzie przez 5 minut i przenieś roztwory do 2 nowych probówek o pojemności 50 ml.
- Odwirować zawiesiny komórkowe w temperaturze 250 x g, 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić każdą osadkę w 8 - 10 ml (około 1 ml / mózg) roztworu do zamrażania składającego się z 10% DMSO w FBS.
- Przenieść zawiesinę komórkową do kriowialiów, używając 1 ml na kriowial. Średnio w wyniku oczyszczenia otrzymuje się 1 fiolkę na użyty mózg, co średnio zapewnia komórki śródbłonka na 12-16 wkładek. Umieścić fiolki w zamrażarce w temperaturze -80 °C na co najmniej 4 godziny, aż do nocy. Następnie przechowuj kriowiale w kriozbiorniku z ciekłym azotem.
ostrożność: Ciekły azot ma bardzo niskie temperatury. Proszę nosić odpowiednią ochronę.