Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB. Przebieg procedury dla protokołu przedstawiono na rysunku 1.
1. Przygotowanie do procedury
- Przygotuj bufor mikronaczyń mózgowych (BMB). Zacznij od zważenia 54,66 g D-mannitolu, 1,90 g EGTA (glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′--tetraoctowy) i 1,46 g zasady 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu (tj. Tris) do czystej zlewki. Dodaj 1,0 l wody dejonizowanej. Wymieszać składniki bufora BMB za pomocą mieszadła magnetycznego. Po dokładnym wymieszaniu roztworu dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1,0 M HCl.
- Przygotuj 26% roztwór dekstranu (MW 75 000) (w/v) przed znieczuleniem zwierząt. Wykonaj następujące kroki, aby przygotować roztwór dekstranu.
nuta: Niezwykle ważne jest przygotowanie tego roztworu z wyprzedzeniem, ponieważ dekstran może potrzebować około 1,5-2 godzin, aby rozpuścić się w buforze wodnym.
- Odważyć sproszkowany dekstran (26 g na 100 ml buforu) do czystej zlewki.
- Odmierz odpowiednią objętość BMB i przelej ją do osobnej, czystej zlewki.
- Powoli wlewać BMB do zlewki zawierającej sproszkowany dekstran. Podczas nalewania BMB należy ręcznie wymieszać sproszkowany dekstran za pomocą szklanego pręta do mieszania.
- Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować pH do 7,4 za pomocą 1,0 M HCl.
nuta: Typowa izolacja mikronaczyń mózgowych od 12 osobników szczurów Sprague-Dawley (samce lub samice; w wieku 3 miesięcy; 200-250 g każdy) wymaga 200 ml roztworu dekstranu (tj. 52 g dekstranu w 200 ml BMB).
2. Ekstrakcja tkanki mózgowej od szczurów Sprague-Dawley
- Po pożądanym leczeniu eksperymentalnym znieczulić szczury Sprague-Dawley za pomocą ketaminy (50 mg/kg; 2,5 ml/kg i.p.) i ksylazyny (10 mg/ml; 2,5 mL/kg I,p.). Rozcieńczyć ketaminę i ksylazynę w 0,9% soli fizjologicznej do końcowych stężeń odpowiednio 20 mg/ml i 4,0 mg/ml. Eutanazja zwierząt przez dekapitację przy użyciu zaostrzonej gilotyny zgodnie z wytycznymi IACUC (Institutional Animal Care & Use Committee). Tę samą procedurę należy zastosować zarówno dla samców, jak i samic szczurów Sprague-Dawley.
- Wytnij skórę z czaszki szczura, wykonując pojedyncze poprzeczne cięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Za pomocą rongeur ostrożnie usuń płytkę czaszki i odsłoń mózg.
- Usuń mózg za pomocą szpatułki. Odłącz mózg i umieść izolowaną tkankę mózgową w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml BMB. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1,0 μl koktajlu inhibitorów proteazy na 1,0 ml buforu BMB.
3. Przetwarzanie mózgu
- Przenieś tkankę mózgową z rurki stożkowej o pojemności 50 ml na czystą szalkę Petriego.
- Za pomocą kleszczy delikatnie zwiń mózg na bibule filtracyjnej o średnicy 12,5 cm, aby usunąć zewnętrzne opony mózgowe, które są luźno przylegające do kory mózgowej. Delikatnie dociśnij tkankę mózgową do bibuły filtracyjnej i ponownie zwiń tkankę. Na tym etapie często obracaj bibułę filtracyjną.
- Oddziel splot naczyniówkowy od półkul mózgowych za pomocą kleszczy.
nuta: Splot naczyniówkowy pojawia się jako przezroczysta błoniasta tkanka zlokalizowana na powierzchni komór mózgowych.
- Delikatnie spłaszcz tkankę mózgową i usuń pozostałe opony mózgowe i opuszki węchowe za pomocą kleszczy.
- Umieść tkankę mózgową kory mózgowej w schłodzonym szklanym moździerzu. Do moździerza dodać 5,0 ml koktajlu inhibitorów proteazy zawierających BMB.
- Za pomocą górnego homogenizatora energetycznego homogenizuj tkankę mózgową za pomocą 15 ruchów w górę iw dół przy 3,700 obr./min. Przeprowadzić homogenizację za pomocą 10 ml moździerza i młynka do chusteczek higienicznych. Pomiędzy homogenizacją każdej pojedynczej próbki należy oczyścić tłuczek przy użyciu 70% etanolu.
nuta: Pociągnięcia homogenizacji powinny być spójne pod względem tempa i wielkości.
- Wlać homogenat do oznakowanych probówek wirówkowych.
4. Etapy wirowania
- Dodać 8,0 ml 26% roztworu dekstranu do każdej oznakowanej probówki wirówkowej zawierającej homogenat mózgu.
- Odwrócić probówkę dwukrotnie, a następnie dokładnie odwirować próbkę. Przeprowadź wirowanie każdej próbki pod różnymi kątami, aby zapewnić dokładne wymieszanie roztworu homogenatu mózgu z 26% roztworem dekstranu.
- Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
nuta: W przypadku niektórych analiz przydatne jest porównanie mikronaczyń mózgowych z miąższem mózgu. Jeżeli wymagana jest ocena ekspresji białka w miąższu mózgu, supernatant z tego etapu wirowania (tj. frakcja miąższowa mózgu) może zostać pobrany i przechowywany w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
- Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego i szklanej pipety Pasteura.
nuta: Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć granulki. W przeciwnym razie ilość pobranych mikronaczyń mózgowych zostanie zmniejszona, co znacznie zmniejszy wydajność białka z tej procedury.
- Zawiesić osad w 5,0 ml koktajlu inhibitorów proteazy zawierających BMB (tj. 1,0 μl koktajlu inhibitorów proteazy na 1,0 ml buforu BMB). Zwiruj granulkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Dodać 8,0 ml 26% dekstranu do każdej probówki wirówkowej i odwirować zgodnie z opisem w krokach 4.1-4.2 niniejszego protokołu.
- Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Za pomocą kolby próżniowej i szklanej pipety odessać supernatant i upewnić się, że osad zawierający mikronaczynie mózgowe nie został naruszony.
nuta: Nadmiar materiału, który przylgnął do ścianki rury, nie zawiera mikronaczyń i należy go dokładnie oczyścić i usunąć.
- Powtórz kroki od 4.5 do 4.8 dodatkowo dwa razy.
- Po zakończeniu 4 etapów wirowania dekstranu dodaj 5,0 ml BMB do każdej granulki i odwiruj, aby ponownie zawiesić próbkę.
nuta: Po wykonaniu kroku 4.10 można pobrać całe mikronaczynia do analizy lokalizacji białek. Można to osiągnąć, pobierając 50 μl porcji ponownie zawieszonych osadów mikronaczyniowych i rozsmarowując je na szklanym szkiełku mikroskopowym. Mikronaczynia są następnie utrwalane na gorąco w temperaturze 95 °C przez 10 minut na bloku grzewczym, a następnie utrwalane w lodowatym etanolu przez dodatkowe 10 minut. Preparaty można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą one potrzebne do badań obrazowych.
