Generowanie neuronów piramidowych korowych z ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Gouder, L., et al,. Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film opisuje metodę przygotowania szklanych szkiełek nakrywkowych pokrytych poliornityną i lamininą w celu zwiększenia adhezji i wzrostu nerwowych komórek macierzystych. Technika ta obejmuje sekwencyjne inkubacje i płukanie, ułatwiając tworzenie macierzy podporowej, która wspomaga wzrost i różnicowanie komórek neuronalnych, naśladując struktury znajdujące się w neuronach.

Protokół

1. Hodowla neuronalna
   nuta: Przeprogramowanie fibroblastów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, przywiązanie do linii grzbietowej kresomózgowia, pochodzenie, amplifikacja i bankowanie późnych progenitorów korowych (LCP) opisano w Boissart i wsp. Różnicowanie neuronalne komórek podobnych do LCP przeprowadzono również według Boissarta i wsp. z niewielkimi modyfikacjami. Opracowano inne procedury bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, a następnie ich różnicowania w neurony. Protokół ten został zachowany, ponieważ pozwala na selektywną produkcję piramidowych neuronów glutaminergicznych.
   1. Potraktuj 6-dołkowe płytki hodowlane szklanymi szkiełkami nakrywkowymi poliornityną (rozcieńczoną do 1/6 w DPBS (Dulbecco s Phosphate Buffered Saline), stężenie podstawowe 0,01%) O/N, a następnie trzy płukania w DPBS. Następnie dodać lamininę (stężenie podstawowe 1 mg/ml, rozcieńczoną 500 razy w DPBS) przez co najmniej 10 godzin pod okapem przepływowym.
   2. Płytkę i wysyłkę NSC o niskiej gęstości (50 000 komórek/^cm2) na 6-dołkowych płytkach hodowlanych ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w 3 ml pożywki hodowlanej składającej się z DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)/F12 (500 ml), 2 fiolki (po 5 ml każda) suplementu N2, 2 fiolki (po 10 ml każda) suplementu B27, 10 ml Pen-Streptomycyny (penicylina = 10 000 jednostek/ml i Streptomycyna = 10 000 jednostek/ml), 1 ml 2-merkaptoetanolu (roztwór podstawowy: 50 mM) i lamininy (1/500), bez czynników wzrostu. KROK KRYTYCZNY: Wykonaj ten krok ostrożnie, dodając komórki powolnymi ruchami obrotowymi, aby zmniejszyć grupowanie komórek.
   3. Usuń pożywkę hodowlaną. Dodać świeżą pożywkę N2B27 zawierającą 2 μg/ml świeżego roztworu lamininy, aby utrzymać neuron przyczepiony do szklanych szkiełek nakrywkowych i uniknąć zbrylania. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Zachowaj część pozostałej pożywki (200 μl) przed dodaniem świeżej pożywki, aby zapobiec wysuszeniu komórki. Alternatywnie postępuj szybko i zmień całkowitą objętość (3 ml).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PD-PBS (1X), bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej	Gibco/ Technologie życiowe	14190169
Bioodczynnik w roztworze poli-L-ornityny	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P4957
Laminina myszy	Dutscher Dominique	354232
Suplement N2	Gibco/ Technologie życiowe	17502048
B-27 Suplement bez wit A (50X)	Gibco/ Technologie życiowe	12587010
DMEM/NAKRĘTKA. MIX F-12 z GLUT-I	Gibco/ Technologie życiowe	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Technologie życiowe	21103049
2-merkaptoetanol	Gibco/ Technologie życiowe	Nr kat. 31350-010
Pióro-steptomycyna	Gibco/ Technologie życiowe	Rozdział 15140-122
Szkło nakrywkowe 13 mm	Firma VWR	631-0150
Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold z DAPI	Gibco/ Technologie życiowe	Zobacz materiał P36931
Tween(R) 20 - Lepka ciecz	Sigma Aldrich Chimie	Zobacz materiał P7949
Ludzkie fibroblasty	Repozytorium biologiczne linii komórkowej Coriell	GM 4603 oraz GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, Stany Zjednoczone
Inkubator CO2
6-dołkowe płytki hodowlane
Piptette (Biblioteka)