Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie i usunięcie mózgu myszy do krojenia
- Przygotuj się do inkubacji perfuzji i plastrów.
- Około 30 minut przed krojeniem należy przygotować roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy o niskiej zawartości wapnia (aCSF) do inkubacji plastra przed zapisem lub obrazowaniem.
- Rozłóż wszystkie niezbędne narzędzia (duże nożyczki z końcem, małe nożyczki sprężynowe, kleszcze anatomiczne, duże nożyczki lub gilotyna, nożyczki do tęczówki, kleszczyki jubilerskie, strzykawka 10 ml z igłą 27G x 1/2 cala, mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 2 cm i pipeta Pasteura ze złamaną końcówką do przenoszenia plastrów) do perfuzji i krojenia, i przygotuj tacę perfuzyjną.
- Ustawić komorę inkubacyjną z natlenionym aCSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 oC i naczyniu hodowlanym wypełnionym roztworem tnącym.
- Przygotuj etap krojenia do krojenia.
- Wytnij mały kawałek 3% agaru o wymiarach około 1 cm3, aby użyć go jako zabezpieczenia dla mózgu i 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm jako guz, który zostanie użyty do podparcia wzgórka dolnego (IC).
- Przyklej backstop do sceny za pomocą kleju cyjanoakrylowego, a także wybrzuszenie po prawej stronie backstopu tak, aby tworzyły kąt 80o.
- Usuń mózg.
- Głęboko znieczulić mysz w 12. dniu po urodzeniu i 20. dniu po urodzeniu (p12-p20, najlepiej p14-18) za pomocą ketaminy 100 mg/kg i ksylaksyny 3 mg/kg (lub porównywalna procedura zatwierdzona przez komisję etyczną).
nuta: Potwierdź prawidłowy poziom znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Ponieważ zwierzę jest krótko pod narkozą, maść okulistyczna nie jest konieczna.
- Używając nożyczek z końcami, odsłoń klatkę piersiową od wyrostka mieczykowatego do szyi.
- Znajdź wyrostek mieczykowaty i wykonaj poziome cięcie o długości około 1,5 cm.
- Wykonaj dwa pionowe nacięcia od końców poprzedniego cięcia poziomego do ramion, każde o około 1,5 cm.
- Przetnij przeponę i połączenia żebrowo-chrzęstne, aby odsłonić serce.
- Małymi nożyczkami sprężynowymi wykonaj małe, 2-5 mm nacięcie w prawym przedsionku, od brzusznej do grzbietowej strony serca.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 cala wstrzyknąć lewą komorę i szybko przelać zwierzętom roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy.
- Gdy krew się oczyści, użyj większych nożyczek, aby usunąć głowę.
nuta: Nie ocenialiśmy systematycznie użyteczności perfuzji. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że perfuzja przezsercowa u tak młodych myszy może być wykonana z prawie 100% sukcesem i ma tę zaletę, że eliminuje czerwone krwinki, które mogą fluoryzować i zakłócać obrazowanie.
- Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
- Za pomocą nożyczek do wygiętej tęczówki przeciąć czaszkę między oczami, a następnie zaczynając od nacięcia między oczami, ostrożnie przeciąć od przodu do tyłu wzdłuż szwu linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić mózgu pod spodem.
nuta: Opona twarda zwykle odpada wraz z czaszką. Jeśli to konieczne, usuń oponę twardą przed ostrożnym usunięciem mózgu.
- Za pomocą kleszczy jubilerskich podważ czaszkę i ostrożnie usuń mózg, a następnie umieść mózg w roztworze do cięcia. Uważaj, aby nie uszkodzić kory mózgowej.
2. Przygotowanie mózgu do krojenia
- Przygotowanie mózgu do montażu na scenie wibratomu.
- Za pomocą szkiełka oznaczonego dwiema liniami o temperaturze 90o i ukośną linią o godzinie 17o od góry po lewej do prawej strony, przecinającej się w miejscu, w którym spotykają się dwie linie, umieść mózg grzbietową stroną do góry, za pomocą żyletki usuń 2-4 mm rostralnego końca mózgu, tworząc płaską powierzchnię.
- Umieść ogonową stronę mózgu do góry na nowo utworzonej płaskiej powierzchni i wyrównaj grzbietową powierzchnię mózgu z poziomą, a linię środkową mózgu z linią pionową.
- Dopasuj żyletkę do linii 17o, przechyl maszynkę pod kątem 30o i usuń około 3 mm prawej kory w podwójnym ukośnym cięciu (17o od płaszczyzny poziomej i 60o od koronalnej).
- Montaż mózgu na etapie wibratomowym.
- Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 2 cm po brzusznej stronie mózgu tak, aby długi wymiar był prostopadły do linii środkowej.
- Ostrożnie nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na obszar przed ogranicznikiem (i po lewej stronie wybrzuszenia).
- Umieść podwójnie ukośnie przyciętą powierzchnię mózgu do kleju tak, aby część ogonowa mózgu i tyłomózgowie były oparte o guz, a prawa strona mózgu była oparta o backstop.
- Delikatnie dociśnij mózg, upewniając się, że cała powierzchnia styka się z komorą krojenia.
3. Uzyskiwanie warstwy kolikulo-wzgórzowo-korowej
- Szybko przejdź do etapu cięcia i umieść w wibratomie, wypełnij stolik roztworem do cięcia.
- Dopasuj ostrze do górnej (brzusznej strony) mózgu.
- Usuń 1-1,5 mm z wierzchołka mózgu, usuń plastry 300-500 μm i oceń głębokość po usunięciu.
Uwaga: Gdy układ scalony, przyśrodkowe ciało kolankowate (MGB) i boczne jądro kolankowate (LGN) są widoczne, a zakręt zębaty tworzy kształt litery "C", weź od jednego do dwóch plasterków o grubości 600 μm. Zobacz rysunek 1A.
- Plastry umieścić w nagrzanej (32 oC) komorze do przechowywania.
