Artykuł metodologiczny

Indukcja in vitro połączeń nerwowo-mięśniowych z modyfikowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło:Lin, C. et al., In vitro Połączenie nerwowo-mięśniowe wywołane przez ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste. J. Vis. Exp.(2020).

Ten eksperyment szczegółowo opisuje metodę generowania połączeń nerwowo-mięśniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wykorzystuje etapowy proces różnicowania w celu promowania rozwoju neuronów mięśniowych i ruchowych oraz tworzenia synaps, dając funkcjonalne połączenia nerwowo-mięśniowe.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)

  1. Rozcieńczyć ECM (patrz tabela materiałów) lodowatym środkiem 1x PBS do końcowego stężenia 2%
  2. Dodaj 1 ml ECM do 49 ml 1x PBS w plastikowej tubie o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
  3. Umieść 1 szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na płytce 6-dołkowej. Dodaj 1,5 ml 2% ECM do każdej studzienki.
  4. Inkubować płytkę studzienki z 2% ECM przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Odessać ECM z płytki studzienki i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przed użyciem.

2. Zróżnicowanie iPSC w kierunku NMJ

  1. Wysiewać 4 x 105 iPSC na basenik na płytce 6-dołkowej przygotowanej w sekcji 1. Upewnij się, że komórki na szkiełku nakrywkowym są wstępnie osadzone w studzience.
    nuta: W tym badaniu wykorzystano linię komórkową 201B7MYOD iPS.
    1. Usuń pożywkę z iPSC na 6 cm naczyniu hodowlanym i umyj iPSC raz za pomocą 1x PBS.
    2. Dodać 1 ml roztworu oddzielającego komórki do naczynia i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Dodaj 3 ml pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych (ES) do naczynia i delikatnie odpipetuj 3 razy.
    4. Zebrać supernatant, który zawiera odłączone iPSC, do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 160 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    5. Ostrożnie odessać supernatant, ponownie zawiesić iPSC w 3 ml pożywki dla komórek ES naczelnych z 10 μM Y27632 i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    6. Rozcieńczyć iPSC pożywką z komórek ES naczelnych i 10 μM Y27632 do stężenia 2 x 105 komórek/ml. Dodać 2 ml iPSC na szkiełko nakrywkowe wstępnie osadzone w studzience opisanej w sekcji 1.

3. Wprowadzenie iPSC do NMJ

  1. W dniu 1, 24 godziny po wysianiu iPSC na płytkę 6-dołkową, usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 2 ml świeżej pożywki z komórek ES naczelnych zawierającej 1 μg/ml doksycykliny do każdego dołka.
  2. Zmienić pożywkę z 2 ml miogenicznej pożywki różnicującej (MDM) (Tabela 1) zawierającej 1 μg/ml doksycykliny (stężenie końcowe) do każdej studzienki. Odświeżaj podłoże codziennie od 2 do 10 dnia.
  3. Od 11 dnia zmieniaj pożywkę na 2 ml pożywki NMJ (Tabela 1) do każdego dołka. Odświeżaj pożywkę co 3-4 dni, a następnie do 30 dnia.
  4. Obserwuj zróżnicowany NMJ za pomocą mikroskopii odwróconej fazy w 30 dniu. NMJ można wykorzystać do następującej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tabela 1: Wzór na medium.

Pożywka do różnicowania miogenicznego (MDM)MEM-alfa500 ml
100mM 2-ME1117μL
Doksycyklina1μg/ml
KSR56 ml (końcowy do 10%)
Pió...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka, czynniki wzrostu i odczynniki
2-merkaptoetanolTeski Nacalai21418-42
B27, GibcoGibco (firma Gibco)Numer katalogowy: 12587-001
BDNF powiedział:Systemy badawczo-rozwojoweZobacz materiał 248-BD
Roztwór do odłączania komórek, AccumaxTechnologie STEMCELLNumer katalogowy #07921
Suszarka punktu krytycznegoHitachiES-2030
DoksycyklinaTakara631311
ECM, Matrigel (obniżony czynnik wzrostu)CorningNumer katalogowy: 356230
Certyfikat GDNFSystemy badawczo-rozwojowe212-GD
Żelowanie, żel IPPersonel GenoZobacz materiał PG20-1
Powlekarka jonowaJEOL (o rany)JEC3000FC
podłoże iPSC, mTeSRTechnologie STEMCELLNumer katalogowy: 85850
Nokaut SR (KSR)Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy: 10828-028
Mikroskopia żywych komórekNikonMikroskop Eclipse Ti
MEM-alfaGibco (firma Gibco)Nr kat. 12571-071
N2, GibcoGibco (firma Gibco)Numer katalogowy: 17502-048
Podłoże nerwowo-podstawoweGibco (firma Gibco)21103-049
NT3Systemy badawczo-rozwojoweZobacz materiał 267-N3
Pożywka dla komórek ES naczelnychReproCell (komórka ReproCellRCHEMD001
SemHitachiS-4700
TemHitachiZobacz materiał H7650
Y27632Wako Chemicals GmbH253-00513
) powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Human iPSCsMYOD InductionMyotube FormationMotor Neuron DifferentiationNeuromuscular JunctionDoxycycline TreatmentROCK InhibitorECM CoatingCell DifferentiationSynapse Formation

Powiązane artykuły