Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Konfiguracja eksperymentalna
- Przed rozpoczęciem pobierania tkanek i komórek sprawdź, czy wszystkie narzędzia są sterylne. W razie potrzeby przeprowadź autoklaw w autoklawie parę ostrych nożyczek chirurgicznych, parę bardzo cienkich kleszczy i parę cienkich standardowych kleszczy. Ponadto, w razie potrzeby, wysterylizuj każdy substrat przed wysiewem komórek za pomocą sterylizacji UV, ekspozycji na etanol lub sterylizacji parowej.
- Przygotowanie pożywek i roztworów podstawowych do zbierania i dysocjacji neuronów
- Przygotuj pożywkę Bottensteina i Sato (BS), dodając 1% penicyliny-streptomycyny (PS) i 1% suplementu N2 do pożywki F12 Ham's. Oblicz końcową potrzebną objętość jako 500 μl na studzienkę (w przypadku korzystania z płytki 24-dołkowej).
- Przygotować wywar kolagenazy dożylnej w pożywce F12 szynki o stężeniu 1,25% wag./v. Przefiltrować-wysterylizować roztwór i przechowywać w temperaturze -20 °C jako 200 μl podwielokrotności.
- Przygotować wywar z bydlęcej trypsyny trzustkowej w pożywce F12 szynki o stężeniu 2,5% wag./v, wysterylizować filtrem i przechowywać w temperaturze -20 °C jako 200 μl podwielokrotności.
- Przygotować roztwór podstawowy czynnika wzrostu nerwów (NGF) o stężeniu 5 μg/ml w sterylizowanym przez filtr roztworze albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 1 mg/ml w pożywce F12 i przechowywać w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności 200 μl. Nie filtrować NGF po rozpuszczeniu.
- W przypadku, gdy nie przeprowadzono modyfikacji powierzchni, pokryć szkiełka nakrywkowe/płytki poli-D-lizyną (0,1 mg/ml przez 15 minut w temperaturze pokojowej [RT]) i/lub lamininą (2-10 μg/cm2 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C) w celu wsparcia przyczepu neuronów i wzrostu neurytów, jeśli jest to właściwe.
- Zawsze przed użyciem należy rozgrzać media w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
2. Zbiór i dysocjacja neuronów zwojów korzenia grzbietowego (DRG)
- Zakończ szczura przez zwichnięcie szyjki macicy i ścięcie głowy. Ogol szczura i unieś skórę, aby odsłonić kręgosłup. Za pomocą ostrych nożyczek wytnij kręgosłup, zwracając szczególną uwagę na zamknięte narządy i naczynia krwionośne. Przenieść kręgosłup do komory bezpieczeństwa biologicznego (klasa II) za pomocą szalki Petriego i usunąć każdą część grzbietową.
- Podziel kręgosłup na pół wzdłuż osi podłużnej za pomocą sterylnych i ostrych nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić tkankę pępowinową. W tym momencie pomocne jest przecięcie kręgosłupa na dwa mniejsze segmenty poniżej poziomu klatki piersiowej, aby ułatwić obsługę podczas pobierania neuronów DRG. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie usuń całą tkankę pępowinową, uważając, aby nie ciągnąć i nie usuwać korzeni DRG. W ten sposób DRG i korzenie zostaną odsłonięte w kanałach kręgowych, nadal zamkniętych w kolumnie. Obserwuj DRG jako białe włókna wychodzące bezpośrednio z kanałów.
- Wyciągnij cały korzeń DRG (nie tylko DRG) z kanałów kręgowych za pomocą bardzo cienkich kleszczy, wchodząc głęboko w kanały kręgowe i zwracając uwagę, aby nie uszkodzić korzeni zwojów. Przenieść DRG na małą szalkę Petriego (60 mm2) zawierającą 3-4 ml pożywki F12 z szynką uzupełnioną o 1% PS. Jeśli używasz różnych zwierząt, użyj oddzielnych naczyń.
- Pod mikroskopem preparacyjnym oczyść DRG z nadmiaru korzeni nerwowych otaczających zwoje za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela, aby zmniejszyć zanieczyszczenie komórek glejowych. Przenieść DRG na małą szalkę Petriego (35mm2) z 1,8 ml świeżej pożywki F12.
- Dodać 200 μl 1,25% wag./v roztworu podstawowego kolagenazy typu IV (końcowe stężenie 0,125%) i inkubować DRG w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę. Ostrożnie zassać pożywkę szklaną pipetą, uważając, aby nie zassać ani nie uszkodzić DRG. Dodać świeżą pożywkę F12 uzupełnioną enzymem kolagenazy typu IV o s.�. 0,125% wag. i inkubować przez 1 godzinę, jak opisano wcześniej.
- Zassać pożywkę i delikatnie umyć DRG pożywką F12. Następnie dodać 1,8 ml pożywki F12 i 200 μl trypsyny (końcowe stężenie 0,25% wag./v) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min.
- Usunąć trypsynę i dodać 1 ml pożywki F12 uzupełnionej 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. Zassać pożywkę i delikatnie przemyć DRG pożywką F12 trzy razy, aby usunąć ślady surowicy.
- Dodać 2 ml świeżej pożywki F12 i ostrożnie przenieść DRG wraz z pożywką do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety. Delikatnie rozdziel neurony DRG, pipetując w górę i w dół (około 8-10 razy) za pomocą szklanej pipety (alternatywnie można użyć plastikowych końcówek).
- Pozwól, aby osadzanie się osadu na dnie probówki i zbierz podłoże w nowej probówce. Dodać 2 ml świeżej pożywki F12 do probówki zawierającej osad i powtórzyć dysocjację mechaniczną za pomocą szklanej pipety. Powtarzaj ten krok, aż zawiesina stanie się jednorodna (około 3-4 razy) i zbierz cały zdysocjowany DRG w nowej probówce. Metoda ta zmniejsza stres wynikający z dysocjacji mechanicznej i poprawia żywotność neuronów.
- Przefiltruj powstałą homogenizowaną zawiesinę do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sitka do komórek 100 μm, aby usunąć niezdysocjowane neurony i inne zanieczyszczenia. Na tym etapie wygodne może być najpierw przefiltrowanie zawiesiny komórek do probówki o pojemności 50 ml, a następnie przeniesienie roztworu do mniejszej probówki za pomocą szklanej pipety. Odwirować zawiesinę o stężeniu 110 g przez 5 minut.
- Przygotować 15% BSA, dodając 500 μl 30% roztworu BSA do 500 μl pożywki F12. Powoli pipetować roztwór w dół ścianki probówki o pojemności 15 ml, aby uzyskać stopniowy ślad białka. Na tym etapie pomocne jest trzymanie rurki pod kątem 45° i powolne zwalnianie BSA, używając cyfr na rurze falcon jako odniesienia dla formującego się "toru".
- Odessać supernatant z kroku 2.10, pozostawiając 500 μl na dnie probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w tym samym podłożu. Powoli pipetować zawiesinę wzdłuż ścieżki białkowej przygotowanej wcześniej w kroku 2.11 (użyć liczb na probówce jako odniesienia) i odwirować przy 500 g przez 5 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml zmodyfikowanego podłoża BS.
nuta: Objętość do ponownego zawieszenia neuronów DRG może być zwiększona do rzeczywistej wymaganej objętości, w zależności od pożądanego końcowego stężenia komórek i liczby próbek do wysiania. Jedno zwierzę dostarczy wystarczającą ilość komórek do eksperymentu na 24-dołkowej płytce.
- Inkubować wysiane próbki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny, aby umożliwić przyłączenie komórek, a na koniec dodać świeżą pożywkę BS uzupełnioną 50 ng/ml NGF.
