1. Utrzymanie komórek macierzystych
UWAGA: Opisany poniżej protokół utrzymania komórek dotyczy pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) utrzymywanych w przylegającej monowarstwie. Pożywki, inne odczynniki i płytki do hodowli komórkowych stosowane przed poddaniem działaniu dimetylosulfotlenku (DMSO) można dostosować w razie potrzeby. W przypadku wszystkich poniższych protokołów zawartych w tym manuskrypcie, komórki powinny być traktowane pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.
- Pokryj sterylne, 6-dołkowe, poddane kulturze tkankowej matrycę lub substrat kwalifikowany do pluripotencjalnych komórek macierzystych przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta i inkubuj przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze CO2 (5% CO2, wilgotna atmosfera). Powlekane płyty można owijać folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
- Rozmrozić kriokonserwowane PSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wysterylizuj fiolkę etanolem przed wprowadzeniem do komory bezpieczeństwa biologicznego, a następnie natychmiast przenieś komórki przez pipetowanie do sterylnej stożkowej probówki zawierającej 5-10 objętości wstępnie podgrzanej pożywki z komórek macierzystych.
- Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Odessać pożywkę i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem kinazy białkowej związanej z 10 μM rho (ROCK), takim jak Y-27632.
- Odessać matrycę hodowlaną z płytki i wysiać komórki o pożądanej gęstości, zwykle 0,5-1 x 106 komórek na studzienkę w co najmniej 2 ml pożywki z komórek macierzystych na studzienkę.
nuta: Gęstość posiewu może się różnić w zależności od linii komórkowych i klonów i powinna być odpowiednio zoptymalizowana.
- Utrzymuj komórki, codziennie zastępując je wstępnie podgrzanym podłożem z komórek macierzystych. Podziel komórki przy około 70%-80% zbiegu lub gdy kolonie komórek zaczną się stykać.
- W celu rozszczepienia komórek należy odessać pożywkę i raz przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Inkubować komórki z 1 ml roztworu enzymu dysocjacyjnego na studzienkę przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
- Umyj i ponownie zawieś komórki za pomocą wstępnie podgrzanej pożywki z komórek macierzystych i przenieś do sterylnej stożkowej probówki z 5-10 objętościami pożywki z komórek macierzystych. Wykonaj kroki 1.3-1.7, aby pokryć komórki.
2. Wstępna obróbka DMSO
UWAGA: Podczas posiewu komórek do wstępnej obróbki DMSO przed różnicowaniem, początkowa gęstość komórek posiewu powinna być zoptymalizowana z uwzględnieniem typowego tempa wzrostu linii komórek macierzystych, jak również stosowanego protokołu różnicowania. W razie potrzeby zweryfikuj pluripotencję za pomocą konwencjonalnych markerów. Komórki powinny być pasażowane co najmniej 1x-2x po wstępnym rozmrożeniu przed różnicowaniem.
- Różnicowanie kultur 2D
- Gdy komórki osiągną odpowiednie zbiegowisko, należy przygotować powlekane płytki, rozdzielić komórki i przygotować zawiesinę jednokomórkową, jak opisano powyżej.
- Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, w tym błękitu trypana lub innego markera żywotności.
- Umieść komórki na powlekanej płytce 6-dołkowej w proporcji 0,5-1 x 106 komórek na dołek w pożywce z komórkami macierzystymi z inhibitorem 10 μM ROCK.
UWAGA: W przypadku linii komórkowych testowanych w naszym laboratorium gęstości te zazwyczaj skutkowały 80%-90% zlewającymi się komórkami w ciągu 24-godzinnej obróbki wstępnej DMSO.
- Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
- Przygotuj 1%-2% DMSO w podgrzanym podłożu z komórkami macierzystymi (np. 100 μL DMSO w 10 ml pożywki = 1% roztwór DMSO lub 200 μl DMSO w 10 ml pożywki = 2% roztwór DMSO).
- Po 24 godzinnej inkubacji odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją roztworem DMSO.
- Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny do 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 w wilgotnej atmosferze) przed różnicowaniem.
UWAGA: Zazwyczaj 24-godzinna kuracja DMSO jest wystarczająca w przypadku większości linii ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ESC i iPSC). Linie komórkowe o bardzo wolnym tempie wzrostu (długie czasy podwajania) mogą odnieść korzyści z 48-godzinnej inkubacji z DMSO. W przypadku 48-godzinnej inkubacji z DMSO, pożywkę można zastąpić świeżą pożywką z komórek macierzystych o zawartości 1%-2% DMSO po pierwszych 24 godzinach leczenia.
3. Różnicowanie do pierwotnych listków zarodkowych
UWAGA: Poniższe opisują metody, które wcześniej okazały się skuteczne w naszym laboratorium dla PSC hodowanych w monowarstwie na płytkach 6-dołkowych. Po leczeniu DMSO należy zastosować dowolny wybrany protokół różnicowania, aby promować różnicowanie do pożądanych linii. Usuń roztwór DMSO po 24-48 godzinach leczenia i kontynuuj różnicowanie zgodnie ze standardowymi protokołami.
- Różnicowanie ektodermy
- Wstępnie potraktuj komórki DMSO, jak opisano powyżej dla kultur 2D.
- Przygotuj roztwory podstawowe Noggin i SB431542.
- Przygotować ektodermalne podłoża bazowe różnicujące, rozpuszczając zastępczą surowicę nokautującą (KOSR) do końcowego stężenia 10% w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco.
nuta: Przygotuj wystarczającą ilość podłoża bazowego na 3-4 dni wymiany nośnika.
- Przygotować ektodermalne pożywki różnicujące, dodając Noggin do końcowego stężenia 500 ng/ml i SB431542 do końcowego stężenia 10 μM do odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanego KOSR/knockout DMEM.
- Po wstępnej obróbce DMSO odessać pożywkę z komórek i zastąpić pożywką różnicującą (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
- Pozostawić komórki do inkubacji przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 (5% CO2 , wilgotna atmosfera), zastępując codziennie pożywkę świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi.