$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie rozwarstwiających i pożywek hodowlanych
- W celu wyizolowania rdzenia kręgowego szczura należy przygotować 100 ml buforu do wypreparowania (1x PBS + 0,6% glukozy + 2% penicyliny-streptomycyny) i przechowywać w lodówce.
- Przygotować 100 ml pożywki bez surowicy (SFM) i ogrzać w temperaturze 37 °C. Aby przygotować SFM, dodaj 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny, 2% B27 i 10% mieszanki hormonów do podłoża Neurobaseal-A. Aby przygotować mieszankę hormonów, przygotuj pożywkę 1:1 DMEM/F12 zawierającą 0,6% glukozy, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 μg/ml insuliny, 100 μg/ml apo-transferyny, 10 μM putrescyny, 30 nM selenu i 20 nM progesteronu.
- Przygotować pożywkę galwaniczną wzbogaconą w czynnik wzrostu EFH (do SFM dodać 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 2 μg/ml heparyny) i ogrzać w temperaturze 37 °C.
2. Pobieranie i preparowanie okołokomorowej tkanki rdzenia kręgowego dorosłego szczura
- Wysterylizuj narzędzia sekcyjne w etanolu i wcześniej spłucz w sterylnej soli fizjologicznej lub narzędziach w autoklawie. Podaj szczurom (w wieku od 6 do 8 tygodni) śmiertelny zastrzyk pentobarbitalu sodu (1 cm³ przy 65 mg / ml) lub przedawkowanie środka znieczulającego (tj. 4% izofluranu) zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem na zwierzętach. Oblaj grzbiet szczura 70% etanolem i usuń skórę z powierzchni grzbietowej dużymi nożyczkami preparacyjnymi.
- Trzymając nożyczki prostopadle do powierzchni grzbietowej, przetnij poprzecznie kręgosłup nad tylnymi kończynami. Użyj mniejszych nożyczek, aby podłużnie przeciąć mięsień grzbietowy leżący nad kręgosłupem w kierunku rostralnym, aby odsłonić wyrostki kolczyste.
- Zaczynając od odsłoniętego końca ogonowego, włóż rongeurs lub mały instrument do cięcia kości zewnątrzoponowo do bocznej części kanału kręgowego w przestrzeni między rdzeniem kręgowym a kręgosłupem. Wykonaj małe nacięcia w blaszce (łuki kostne po lewej i prawej stronie wyrostków kolczystych po obu stronach kręgów) i ostrożnie oderwij blaszkę, aby odsłonić rdzeń kręgowy (ryc. 1A-D). Upewnij się, że kąt ostrzy jest płytki i równoległy do rdzenia, aby leżący pod spodem rdzeń kręgowy nie został uszkodzony.
- Kontynuuj laminektomię w kierunku rostralnym, aby odsłonić rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym i szyjnym.
- Delikatnie wytnij rdzeń kręgowy z kręgosłupa za pomocą kleszczy tkankowych i użyj mikronożyczek, aby ostrożnie odciąć korzenie, aby uwolnić pępowinę. Umieścić wycięty rdzeń kręgowy na szalce Petriego zawierającej 4 °C sterylny bufor do preparacji szczurów (opisany powyżej w ppkt 1.1). Wypłukać tkankę w świeżo przygotowanym buforze preparacyjnym o temperaturze 4 °C i przeciąć rdzeń kręgowy poprzecznie na segmenty o długości 1 cm za pomocą nożyczek (ryc. 1E).
- Dla każdego segmentu tkanki użyj jednej ręki, aby przytrzymać tkankę za pomocą cienkich kleszczy. Z drugiej strony użyj mikronożyczek, aby ostrożnie usunąć leżące nad nimi opony mózgowe, istotę białą i większość istoty szarej za pomocą lunety sekcyjnej. Alternatywnie, użyj cienkich kleszczyków (Dumont #4), aby usunąć większość istoty szarej i białej, pozostawiając tylko obszar okołokomorowy rdzenia kręgowego, który obejmuje wyściółczak i niewielką ilość otaczającej istoty szarej (ryc. 1F-H).
- Zebrać wypreparowaną tkankę okołokomorową na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm, zawierającej zimny bufor do preparowania szczurów.
3. Izolacja i hodowla NSPC rdzenia kręgowego dorosłego szczura
- Następujące czynności należy wykonać aseptycznie w okapie z przepływem laminarnym.
- Rozdrobnić wypreparowaną tkankę okołokomorową szczura na kawałki o średnicy 1 mm za pomocą mikronożyczek.
- Enzymatycznie zdysocjować tkankę mieloną za pomocą enzymów proteolitycznych za pomocą zestawu do dysocjacji papainy, jak wskazano w tabeli materiałów/odczynników.
nuta: Składniki odczynnika obejmują cztery fiolki: Fiolka 1: Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS). Fiolka 2: Papaina zawierająca L-cysteinę i EDTA. Fiolka 3: Deoksyrybonukleaza I (DNaza). Fiolka 4: Inhibitor proteazy jajowatej z albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
UWAGA: Papaina jest proteazą sulfhydrylową o szerokiej specyficzności dla substratów białkowych. Papaina w tym miejscu pochodzi z lateksu rośliny Carica papaya i rozkłada większość substratów białkowych w większym stopniu niż proteazy trzustkowe. Podczas procesu dysocjacji dochodzi do uszkodzenia komórek, które powoduje uwolnienie DNA do podłoża dysocjacyjnego, co zwiększa lepkość i utrudnia pipetowanie. W ten sposób DNaza jest włączana do procedury izolacji komórek w celu strawienia DNA bez uszkadzania nienaruszonych komórek. Ovomucoidy to inhibitory proteazy glikoproteinowej stosowane do hamowania aktywności papainy po etapie dysocjacji.
- Przy pierwszym użyciu należy rozpuścić mieszaninę inhibitorów albuminy owomkoidów (fiolka 4) w 32 ml EBSS (fiolka 1), a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować do kolejnych izolacji. nuta: W ten sposób otrzymuje się roztwór o efektywnym stężeniu 10 mg inhibitora owamukoidów i 10 mg albuminy na ml.
- Dodać 5 ml EBSS (fiolka 1) do fiolki z papainą (fiolka 2), otrzymując roztwór o stężeniu 20 jednostek papainy/ml w 1 mM L-cysteiny z 0,5 mM EDTA. Sprawdź, czy roztwór papainy jest przezroczysty po całkowitym rozpuszczeniu. W przeciwnym razie należy umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na dziesięć minut, aż papaina całkowicie się rozpuści, aby zapewnić całkowitą aktywność enzymu.
- Dodać 500 μl EBSS (fiolka 1) do fiolki DNazy (fiolka 3) i delikatnie wymieszać, ponieważ DNaza jest wrażliwa na denaturację ścinającą. Dodać 250 μl roztworu DNazy do fiolki z papainą, uzyskując końcowe stężenie około 20 jednostek/ml papainy i 0,005% DNazy. Zachowaj pozostałą DNAzę do późniejszego wykorzystania.
- Umieść zmieloną tkankę szczura w roztworze papainy.
- Inkubować w temperaturze 37 °C ze stałym mieszaniem na platformie kołyskowej w celu dysocjacji tkanki w aktywowanym roztworze papainy. Inkubować tkankę szczura przez 45 minut do 1 godziny.
- Rozprowadzić mieszaninę za pomocą pipety o pojemności 10 ml w celu dysocjacji pozostałych fragmentów tkanki w celu uzyskania mętnej zawiesiny komórek. Przenieść zawiesinę komórkową (nie zawierać żadnych kawałków niezdysocjowanej tkanki) do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce zawierającej ovomucoid, inhibitor papainy.
- Przygotować roztwór jajomkoidów, mieszając 2,7 ml EBSS (fiolka 1) z 300 μl odtworzonego roztworu inhibitora albuminy i owomukoidu (fiolka 4) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 150 μl roztworu DNazy (fiolka 3).
- Wyrzucić supernatant z granulowanych komórek i natychmiast ponownie zawiesić osad komórkowy w rozcieńczonej mieszaninie DNazy i inhibitora albuminy.
- Oddziel nienaruszone komórki od błon komórkowych przez odwirowanie przez jednoetapowy nieciągły gradient gęstości.
- Przygotować nieciągły gradient gęstości, dodając 5 ml roztworu inhibitora albuminy (fiolka 4) do probówki o pojemności 15 ml i używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie i powoli nakładać zawiesinę komórkową (przygotowaną w sposób opisany powyżej) na wierzch roztworu inhibitora albuminy.
- Wirować przy 70 x g przez 6 min w temperaturze RT.
nuta: Granica między dwiema warstwami gradientu powinna być wyraźnie widoczna, chociaż minimalne mieszanie na tej granicy nie wpływa na wynik. Fragmenty błony pozostają na granicy faz, a zdysocjowane komórki osadzają się na dnie probówki.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki EFH dla szczurów (podgrzanej w temperaturze 37 °C). Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki w kolbie hodowlanej T25 o gęstości 10 komórek/μl w EFH. Typowa wydajność komórek z tkanki szczura wynosi około 2 x 106 komórek o około 80% żywotności. Jeśli pożądane są hodowle klonów, należy nasiać komórki o gęstości mniejszej niż 10 komórek/μl. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i pozostawić kultury do niezakłóconego wzrostu przez 1 tydzień, aby uniknąć agregacji kulek.
