Izolowanie i hodowla perycytów mózgowych myszy

Streszczenie

Źródło: Mehra, A., et al., Wysokowydajna metoda izolacji perycytów mózgowych od myszy. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje metodę izolowania perycytów mózgowych od mózgu myszy. Wyizolowane komórki są hodowane w pożywkach specyficznych dla perycytów w celu promowania proliferacji perycytów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 500 ml buforu myjącego A (WBA): 10 mM roztworu HEPES w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 500 ml buforu myjącego B (WBB): 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 10 mM roztworu HEPES w HBSS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować 300 ml 30% roztworu dekstranu w WBA, mieszając roztwór przez noc w temperaturze pokojowej. Przed użyciem roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 110 °C przez 30 minut. Po autoklawowaniu pozostaw roztwór w temperaturze pokojowej na 2-3 godziny. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
4. Przygotować 100 ml 0,1% roztworu BSA w zimnym roztworze dekstranu. Wstrząsać energicznie przez 3-4 minuty i przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), rozpuszczając 20% surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy, 50 μg/ml gentamycyny, 1% witamin, 2% aminokwasów Basal Medium Eagle (BME) w pożywce Basal DMEM i przechowuj w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać 1 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
6. Przygotować kompletną pożywkę dla perycytów, dodając suplementy wzrostu perycytów (dostarczane z pożywką dla perycytów) i 20% surowicy cielęcej płodu (FCS) w pożywce podstawowej do hodowli perycytów i przechowuj w temperaturze 4 °C.

2. Regeneracja tkanki mózgowej i usuwanie opon mózgowych

1. Aby zachować spójność, używaj myszy w podobnym wieku i tej samej płci w każdej partii ekstrakcji. Korzystaj ze schroniska dla zwierząt wolnego od patogenów i zapewnij ad libitum dostęp do wody. Aby zapewnić wydajność i minimalne wykorzystanie zwierząt, należy unikać utraty materiału tkankowego.
2. Eutanazja C57BL/6J, 4-6 tygodniowe, samce myszy (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, Francja).
3. Szybko wyciąć tkankę mózgową w sterylnych warunkach, unikając uszkodzenia tkanki. Ostrożnie umieść tkankę w 40 ml soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (PBS).
4. Przenieś tkankę mózgową w zimnym PBS na szalkę Petriego (100 mm x 15 mm).
5. Umieść tkankę mózgową na sterylnej, suchej, niestrzępiącej się chusteczce i za pomocą kleszczyków z zakrzywioną końcówką usuń móżdżek, prążkowie i nerwy potyliczne.
   1. Usuń wszystkie widoczne opony mózgowe za pomocą bawełnianego wacika. Umieść tkankę mózgową do góry nogami i otwórz płaty bawełnianym wacikiem, wykonując lekkie pociągnięcia na zewnątrz. Usuń wszystkie widoczne naczynia krwionośne.
   2. Umieść wolną od opon mózgowych tkankę mózgową na szalce Petriego (100 mm x 15 mm) z 15 ml zimnego WBB.

3. Homogenizacja

1. Przenieś tkankę do probówki z moździerzem do mielenia tkanek Dounce i dodaj 3-4 ml WBB za pomocą kleszczy.
2. Zmiel tkankę "luźnym" tłuczkiem 55 razy. Opłucz "luźny" tłuczek WBB. Teraz zmiel gnojowicę "ciasnym" tłuczkiem 25 razy.
3. Podziel zawiesinę równo na dwie probówki o pojemności 50 ml i dodaj 1,5 razy więcej zimnego 30% dekstranu BSA, energicznie potrząsając probówkami, aby wymieszać gnojowicę.

4. Izolacja frakcji naczyniowej

1. Po energicznym wstrząśnięciu probówkami odwirować je przez 25 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C.
2. Przenieść supernatant (wraz z górną warstwą mieliny) do 2 nowych probówek i odwirować probówki przez 25 minut w temperaturze 3 000 x g i 4 °C. Zachować granulki z pierwszego wirowania, dodając 3 ml zimnego WBB (utrzymać osad w temperaturze 4 °C).
3. Powtórz krok 4.2 i ostrożnie zachowaj granulki z drugiego wirowania.
4. Wyrzucić dekstran i mielinę wraz z resztkami tkanek z probówek z kroku 4.3. Zachowaj granulki w zimnym WBB.
5. Zebrać zawartość probówki 1 i probówki 2 z kroku 4.1 i uzupełnić do końcowej objętości 10 ml zimnym WBB.
6. Powtórz ten krok dla rur z kroku 4.2 i kroku 4.3.
   UWAGA: Na koniec są 3 probówki z 3 wirówek.
7. Odciąć osad za pomocą 6 ruchów w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aż nie pozostaną żadne widoczne grudki granulek.
8. Przefiltruj zawiesiny komórek każdej rurki za pomocą zespołu filtra próżniowego i nylonowego filtra siatkowego.
   nuta: Ten etap filtracji jest ważny w celu usunięcia dłuższych/większych naczyń za pomocą filtra siatkowego.
9. Odzyskaj i ponownie zamieść kapilary, zeskrobując filtr za pomocą kleszczyków z płaską końcówką lub skrobaka w WBB w temperaturze pokojowej. Przefiltruj zawiesinę świeżym filtrem, aby odzyskać więcej naczyń włosowatych
10. Podzielić filtrat równomiernie na dwie probówki i odwirowywać przez 7 minut przy 1 000 x g i RT.
    UWAGA: Na tym etapie wirowania przygotuj roztwór enzymatyczny. Określić wymaganą ilość WBB w zależności od liczby wykorzystanych zwierząt (patrz tabela materiałów). Dodać 1x DNazy 1 i 1x chlorowodorku tozylo-L-lizylochlorometanu (TLCK) (patrz tabela materiałów) w WBB i ogrzać do temperatury 37 °C.
11. Zebrać granulki z kroku 4.10 w jednej probówce z wstępnie podgrzanym WBB z enzymami. Dodaj podgrzaną 1x kolagenazę/dispase. Umieścić probówkę w łaźni wodnej ze stołem do wytrząsania w temperaturze 37 °C dokładnie na 33 minuty.
12. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 30 ml zimnego WBB. Odwirowywać zawiesinę przez 7 minut przy 1 000 x g i RT.
13. Ostrożnie odrzucić supernatant i oddzielić osad w WBB wykonując 6 ruchów w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Ten krok powinien być mniej rygorystyczny i stosunkowo szybszy.
14. Odwirowywać zawiesinę przez 7 minut przy 1 000 x g i RT.
    UWAGA: Na tym etapie wyrzuć powłokę z naczyń hodowlanych i spłucz je raz DMEM w temperaturze pokojowej. Szalki z kulturami komórkowymi należy pokrywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
15. Odrzucić supernatant z probówki otrzymanej w kroku 4.14 i rozdzielić osad w nowym, kompletnym pożywce DMEM, pokryć komórki (Dzień 0, P0) w 9 dołkach z płytkami 6-dołkowymi (1 dołek o powierzchni 9,6 cm2 każda).

5. Proliferacja perycytów mózgowych

1. Hodowle komórkowe należy utrzymywać w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w sterylnym inkubatorze. Wymień pożywkę hodowlaną po 24 godzinach (dzień 1) od posiewu komórek, ostrożnie usuwając resztki. Po 1 dniu zmieniaj pożywkę co 48 godzin.
2. Obserwuj kulturę komórkową przez co najmniej 7-8 dni. Do tego czasu powinny być widoczne narośla komórkowe na szczycie jednowarstwy śródbłonka.
3. Przejście komórek w 8-10 dniu (w zależności od zbiegu) w pożywce do hodowli perycytów do przejścia 1 (P1) na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni. Obserwuj komórki przez 6-7 dni. Komórki są kolejno ponownie dzielone do pasażu 2 (P2) w dniu 17 [i pasażu 3 (P3) w dniu 24 tylko w razie potrzeby], hodowane w pożywce perycytowej na płytkach pokrytych żelatyną.
   nuta: Komórki powinny być gotowe do eksperymentów/obserwacji przy prawie 80-90% zbieżności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aminokwasy BME	Sigma	B-6766	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Podstawowe podłoża DMEM	Invitrogen	316000083	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów	Sigma	F-0291	Przechowywać w temperaturze -20 °C.
Bsa	Sigma	A-8412	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Kolagenaza dispaza	Sigma	10269638001	Przygotować 10-krotny roztwór podstawowy w sterylnym PBS-CMF. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C. Uwaga: Na etapie trawienia enzymatycznego w protokole, na każdy zestaw 10 myszy do ekstrakcji wymagane jest 300 μl 10-krotnej dypazy kolagenazy.
Dekstran	Sigma	Numer katalogowy: 31398
DNaza I	Sigma	11284932001	Przygotować roztwór podstawowy 1000X, rozpuszczając 100 mg w 10 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze -20°C.
żelatyna	Sigma	G-2500	Przygotować powłokę roboczą, sporządzając 0,2% roztwór żelatyny w sterylnym PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH2PO4, 2,86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez co najmniej 20 minut w temperaturze 120 °C i przechowywać w temperaturze pokojowej. Szalki hodowlane należy obtaczać przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C.
Gentamycyna	Biochrom AG	A-2712	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
glutamina	Merck	I.00289	Przechowywać w temperaturze -20 °C.
HBSS (Sieć HBSS)	Sigma	H-8264	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
HEPESY	Sigma	H-0887	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Matrigel	Powłoka biologiczna BD	Numer telefonu 354230	Przygotować roboczy roztwór powlekający Matrigel, rozcieńczając bulion w zimnym DMEM w stosunku 1:48 z jego końcowym stężeniem wynoszącym 85 μg/cm2. Naczynia z kultur komórkowych należy pokrywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Pericyte Medium-mysz	Laboratoria badawcze Sciencell	1231	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Tosyl Lizyna Keton chlorometylowy	Sigma	T-7254	Przygotować 1000-krotny roztwór podstawowy w WBA, rozpuszczając 16 mg w 10,88 ml WBA, aby uzyskać roztwór o stężeniu 4 mM i przechowywać w temperaturze 4 °C.
witaminy	Sigma	B-6891	Przechowywać w temperaturze -20 °C.
Narzędzia filtrujące	Sefar, Siatka nylonowa, porowatość 60 mikronów
Sprzęt laboratoryjny	Wirówka z wirnikiem kubełkowym obrotowym
Łaźnia wodna z mieszadłem
Okap z przepływem laminarnym: BSL2
Wyroby szklane (wszystkie elementy do sterylizacji termicznej)	Młynek do tkanek do skakania ze szklanym tłuczkiem
Tłuczek I: 0,0035 - 0,0065 cala
Tłuczek II: 0,0010 - 0,0030 cala
Zespół filtra próżniowego z podstawą nośną filtra ze szkła spiekanego o grubej porowatości