$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotuj mieszankę enzymów 1 i 2 dla każdej próbki
UWAGA: Dla objętości większych niż 2 ml użyj pipety serologicznej 10 ml; dla objętości 200 μL-2 ml użyj pipety 1000 μL; dla objętości 21-199 μL użyj pipety 200 μL; dla objętości 2-20 μL, użyj pipety 20 μL; dla objętości poniżej 2 μL, użyj pipety 0-2 μL.
- Dla każdej próbki rozmrozić po jednej porcji enzymu P i enzymu A w temperaturze pokojowej.
- W przypadku mieszanki enzymatycznej 1 połącz 50 μl enzymu P i 1900 μl buforu Z w oznakowanej probówce C (tabela materiałów).
- W przypadku mieszaniny enzymów 2 dodać 20 μl buforu Y do rozmrożonych 10 μl podwielokrotności enzymu A.
2. Protokół dysocjacji mózgu dorosłego
UWAGA: Podczas pracy z próbkami, probówki powinny być umieszczone w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej, podczas gdy BSA i D-PBS pozostają na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
- Włącz dysocjator.
- Użyj kleszczy, aby przenieść fragmenty tkanki hipokampa do rurki C.
- Przenieś 30 μl mieszanki enzymów 2 do probówki C. Przekręć nakrętkę, aż poczujesz napięcie, a następnie dokręć, aż usłyszysz kliknięcie.
- Umieść rurkę C do góry nogami w pozycji dysocjatora; próbce zostanie przypisany stan Wybrany (Rysunek 1). Przymocuj grzejnik do rurki C.
- Naciśnij ikonę folderu, wybierz folder Ulubione, przewiń i wybierz 37C_ABDK_02 program. Kliknij OK, aby zastosować program do wszystkich wybranych lamp C, a następnie dotknij Start (Rysunek 1).
- Oznaczyć jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml na próbkę.
- Umieścić sitko o pojemności 70 μm na każdej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilżyć 2 ml buforu BSA.
- Po zakończeniu programu wyjmij grzałkę i rurkę C z dysocjatora.
- Dodać 4 ml buforu BSA do próbki i nanieść mieszaninę na sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
- Dodaj 10 ml D-PBS do probówki C, zamknij ją i delikatnie zamieszaj roztwór. Nałóż go na sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
- Wyrzuć sitko do komórek i rurkę C. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Następnie odessać i wyrzucić supernatant.
3. Usuwanie gruzu
- Zawiesić osad w 1550 μl zimnego D-PBS i przenieść zawiesinę do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Dodać 450 μl zimnego roztworu do usuwania zanieczyszczeń i pipetować w górę iw dół (nie wirować).
nuta: Roztwór do usuwania zanieczyszczeń to odczynnik w komercyjnym zestawie do dysocjacji Briana dla dorosłych.
- Delikatnie nałóż 1 ml zimnego D-PBS na zawiesinę komórkową, przytrzymując końcówkę przy ściance stożkowej rurki. Powtarzaj, aż całkowita ilość nakładki wyniesie 2 ml.
nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie; Wykonuj z wprawą i zręcznością.
- Wirować przy 3000 x g przez 10 min w temperaturze 4°C z pełnym przyspieszeniem i pełnym hamowaniem.
nuta: Jeśli fazy nie są wyraźnie oddzielone, powtórz kroki 7.2-7.3. Odwirować po raz ostatni przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
- Zawiesina powinna teraz składać się z trzech odrębnych warstw (rysunek 2). Zassać najwyższą warstwę. Przesuwaj końcówkę pipety w przód i w tył, aby zassać białą środkową warstwę. Usuń jak najwięcej środkowej warstwy, nie naruszając najniższej warstwy.
nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie; Wykonuj z wprawą i zręcznością.
- Dodaj 2 ml zimnego D-PBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.
- Wirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C z pełnym przyspieszeniem i pełnym hamowaniem. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu BSA.
UWAGA: W tym momencie komórki można ponownie zawiesić w odpowiednim buforze, a następnie znakować magnetycznie i izolować w ramach przygotowań do sekwencjonowania pojedynczych komórek.
