Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej

Streszczenie

Źródło: DiSano, K. D., et al. Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych do dalszej analizy komórek odpornościowych. J. Vis. Exp. (2020).

Film demonstruje przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne w celu uwolnienia komórek z tkanki mózgowej, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania komórek odpornościowych na podstawie ich gęstości w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie jednokomórkowych zawiesin tkanki mózgu i rdzenia kręgowego

1. Przenieść tkankę mózgu lub rdzenia kręgowego z pożywką na szczyt płytki Petriego o średnicy 100 mm, wylewając tkankę i pożywkę z probówki. Za pomocą kleszczy przesuń tkankę na dno szalki Petriego. Drobno zmiel mózg lub rdzeń kręgowy sterylną żyletką. Za pomocą żyletki przenieś zmieloną tkankę na dno płytki, zeskrobując, aby zebrać tkankę.
   nuta: W przypadku poniższego protokołu trawienia enzymatycznego maksymalnie dwa rdzenie kręgowe mogą zostać połączone razem w celu przetworzenia. Mózgi powinny być przetwarzane indywidualnie.
2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodaj 3 ml RPMI (pożywka Roswell Park Memorial Institute (uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) na szalkę Petriego. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić tkankę w podłożu i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   nuta: Jeśli dalsze zastosowanie polega na analizie sekwencjonowania pojedynczej komórki lub masowego RNA lub hodowli komórek, partie FCS powinny zostać przetestowane, aby upewnić się, że komórki nie są aktywowane przed analizą. Alternatywnie, komórki mogą być przetwarzane przy użyciu 1x PBS z 0,04% BSA zamiast RPMI z 10% FCS.
3. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, umyć szalkę Petriego dodatkowymi 2 ml pożywki w celu zebrania wszelkich resztek tkanki i przeniesienia do stożkowej probówki o całkowitej objętości 5 ml. Utrzymuj probówki na lodzie między etapami przetwarzania.
4. Za pomocą pipety ponownie zawiesić proszek kolagenazy I w pożywce Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aby uzyskać pożądane stężenie (tj. 100 mg/ml). Dodać kolagenazę typu I do stożkowej probówki zawierającej próbkę tkanki mielonej, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe (tj. 50 μl dla 1 mg/ml).
   nuta: Wyższe stężenia kolagenazy zwiększą wydajność komórek, ale mogą rozszczepić markery powierzchni komórek. W związku z tym partie kolagenazy I należy miareczkować w celu określenia optymalnego stężenia potrzebnego do uzyskania jak największej liczby żywotnych komórek z nienaruszonymi wszystkimi wymaganymi markerami powierzchni komórek. Na przykład kolagenaza I została przetestowana w końcowych stężeniach 0,5 mg/ml, 1 mg/ml i 2 mg/ml na pojedynczych próbkach mózgu lub rdzenia kręgowego. Żywotność komórek określono za pomocą metody wykluczenia błękitu trypanowego, a markery powierzchniowe komórek CD45, CD19 i CD4 oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Stężenie kolagenazy I wynoszące 1 mg/ml dało najwyższą liczbę żywych komórek przy zachowaniu wszystkich interesujących markerów powierzchniowych komórek. W związku z tym stężenie to wykorzystano do dalszych eksperymentów badających te typy komórek.
5. Delikatnie zawiesić proszek DNazy I za pomocą 0,15 M chlorku sodu do żądanego stężenia podstawowego. Dodać zawieszoną DNazę I do stożkowej probówki zawierającej próbkę tkanki mielonej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 U/mL.
   nuta: Partie DNazy I różnią się w zależności od jednostek aktywności na ml. Stężenie, które należy dodać do próbki tkanki, zmieni się w zależności od jednostek aktywności fiolki podstawowej na mililitr. Końcowe pożądane stężenie na próbkę wynosi 20 U/ml.
6. Umieścić probówki w stojaku na probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 40 minut. Odwracać probówki co 15 minut, aby dokładnie wymieszać tkankę z enzymami. Po inkubacji dodać 500 μl 0,1 M EDTA (pH = 7,2) do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 M EDTA i inkubować przez dodatkowe 5 minut w celu inaktywacji kolagenazy.
7. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, dodaj 9 ml RPMI uzupełnionego 10% FCS do każdej probówki, aby uzyskać objętość każdej probówki do ~14,5 ml. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety Pasteura z próżnią odessać supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu komórkowego.
8. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 3 ml 100% roztworu gradientu gęstości izotonicznej do probówki zawierającej osad komórkowy. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj dodatkowe podłoże RPMI 10% FCS, aby doprowadzić końcową objętość do 10 ml i ponownie zawieś osad komórek, aby utworzyć 30% warstwę gradientu gęstości izotonicznej roztworu.
   nuta: Przygotować wcześniej 100% podstawowe podłoże o gradientzie gęstości izotonicznej, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Aby przygotować 100% podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej, należy rozcieńczyć pożywkę o gradiencie gęstości (tabela materiałów) buforem do rozcieńczania pożywki o gradiencie gęstości. Przygotować bufor do rozcieńczania pożywek gradientu gęstości (80,0 g/l NaCl, 3,0 g/l KCl; 0,73 g/L Na₂HPO₄, 0,20 g/L KH₂PO₄; 20,0 g/l glukozy) i przefiltrować sterylizować za pomocą systemu filtrów próżniowych. Przygotuj 100% podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej, mieszając 1 część bufora rozcieńczania gradientu gęstości i 9 części pożywki gradientu gęstości. Dobrze wymieszaj.
9. Odwróć i dobrze wymieszaj każdą probówkę przed dodaniem 70% podkładu z gradientem gęstości izotonicznej. Włożyć na dno probówki pipetę serologiczną o pojemności 1 ml zawierającą 1 ml 70% podstawowego roztworu gradientu gęstości izotonicznej. Powoli nałóż 1 ml roztworu, uważając, aby nie powstały bąbelki. Powoli wyjąć pipetę serologiczną z probówki, uważając, aby nie naruszyć gradientu.
   nuta: W przypadku 70% podkładu, 100% podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej należy rozcieńczyć do 70% przy użyciu pożywek RPMI (tj. 7 ml 100% roztworu gradientu gęstości izotonicznej i 3 ml pożywki RPMI dobrze wymieszanej). Dodatkowo, stworzenie czystego, niezakłóconego 70% podkładu jest niezbędne do usunięcia resztek mieliny i uzyskania czystych zawiesin jednokomórkowych na granicy gradientów po odwirowaniu.
10. Wirować przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C bez hamulca. Odessać supernatant, w tym warstwę resztek mieliny, aż w probówce pozostaną 2–3 ml, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórkowej. Zbierz warstwę komórek między gradientem gęstości 30/70% za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieś do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
11. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, dodaj pożywkę RPMI 10% FCS, aby uzyskać ostateczną objętość do 15 ml. Wirować 450 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    nuta: Na tym etapie w razie potrzeby można połączyć warstwy komórek z dwóch probówek. Nie łącz więcej niż dwóch probówek, w przeciwnym razie ogniwa nie będą się osadzać ze względu na stężenie mediów gradientowych o dużej gęstości.
12. Ostrożnie odessać supernatant, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości/buforze, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru (np. ponownie zawiesić pojedynczy rdzeń kręgowy w 250 μl buforu FACS w celu dalszego barwienia powierzchni) (Rysunek 1).
13. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś zawiesiny komórek na górną część górnej probówki filtra (tabela materiałów) i pozwól komórkom przefiltrować się na dno probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki mieliny.
14. Używając barwnika wykluczającego błękit trypanowy, rozcieńczyć go i policzyć komórki na hemocytometrze, uśredniając co najmniej dwie siatki 16-kwadratowe dla dokładności40,41.
15. Postępuj zgodnie z żądaną techniką analizy pojedynczej komórki.
    nuta: Korzystając z różnych form kolagenazy (tj. D, typ I, typ II, typ IV), komórki odpornościowe, mikroglej (ryc. 1), astrocyty, perycyty, komórki śródbłonka49 i neurony50 mogą być skutecznie izolowane. Liczba komórek jądrzastych uzyskana dla wyników była następująca przy użyciu miareczkowanego enzymu kolagenazy I: Cały mózg traktowany pozorem = 500 000–600 000 komórek; Cały mózg TMEV-IDD = 800 000–1 000 000 komórek; Cały rdzeń kręgowy leczony pozorem = 150 000–200 000 komórek; Cały rdzeń kręgowy TMEV-IDD = 300 000–400 000. Liczba komórek będzie się różnić w zależności od precyzji pobierania, przetwarzania i tego, czy występuje zapalenie OUN.

Wyniki

Rysunek 1: Identyfikacja komórek odpornościowych naciekających CD45hi w tkankach OUN. (A) Strategia bramkowania do identyfikacji naciekających komórek odpornościowych CD45hi (P1), mikrogleju CD45lo (P2) i oligodendrocytów, astrocytów i neuronów CD45- wśród wszystkich żywych komórek w rdzeniach kręgowych od myszy pozorowanych (czerwonych) lub TMEV-IDD (niebieskich). Minimalne komórki CD45hi wykryt...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej	ThermoFisher Naukowy	37002D
wirówka	Beckman Coulter	Wirówka Allegra X-12R
Kolagenaza I	Worthington	LS004196
Probówka stożkowa, 15 ml	Firma VWR	525-1069
Probówka stożkowa, 50 ml	Firma VWR	Numer katalogowy: 89039-658
Szkło nakrywkowe	Firma Hauser Scientific	5000
Zakrzywione kleszcze	Narzędzia naukowe	11003-14
Jednorazowa tubka polistyrenowa, 14 ml	Fisher Naukowy	14-959-1B
DNaza I	Worthington	LS002139
suchy lód	Gaz powietrzny	N/a
Durmont #7Forceps	Narzędzia naukowe	Rozdział 11271-30
EDTA sól disodowa dwuwodna	Amresco (angielski)	0105-500g
Etanol, 100%	jakikolwiek	N/a
Górna rurka filtra, 5 ml	Firma VWR	352235
Możliwa do naprawienia plama żywotności 780	Becton Dickinson	565388
glukoza	Fisher Chemiczny	Zobacz materiał D16-500
Roztwór soli zbaczałowanej Hanka (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometr	Andwin Naukowy	02-671-51B
Hemostat	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 13004-14
HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy)	ThermoFisher Naukowy	15630080
Kcl	Chemia Fisher	Zobacz materiał BP366-500
KH2PO4 (postać bezwodna)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P5655-100G
Ciekły azot	Gaz powietrzny	N/a
Blok myszy FC (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (postać bezwodna)	Fisher Chemiczny	Zobacz materiał S374-500
Zawartość NaCl	Chemia Fisher	S671-500
Igła, rozmiar 25	Becton Dickinson	305122
Normalna surowica myszy	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 31881
Sitko z siatki nylonowej	Firma VWR	Numer katalogowy: 352350
Paź	Sakura Sakura	Numer katalogowy: 4583
Paraformaldehyd, 20%	Nauki o mikroskopii elektronowej	15713-S	Rozcieńczony do 4% przy użyciu 1 x PBS
Pipeta Pasteura, 9 cali, bez prądu	Fisher Naukowy	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	21-040-CV
PE Szczur Anty-Myszy CD4	Becton Dickinson	Numer katalogowy: 553730
PE-CF594 Szczur Anty-Myszy CD19	Becton Dickinson	562329
Media gradientowe o gęstości Percoll	GE Opieka zdrowotna	Numer katalogowy: 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Szczur Anty-Myszy CD45	Becton Dickinson	550994
szalka Petriego, 100 mm	Firma VWR	353003
pH-metr	Fisher Naukowy	13-636-AB150
Pomoc w pipetowaniu	Korporacja Naukowa Drummond	Numer telefonu 4-000-101
Pipeta 200 μl	Gilson	FA10005M
Końcówki do pipet, 1 ml	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1111-2831
Końcówki do pipet, 200 μl	USA Naukowe	Lata 1111-1816
Pipeta, 1 ml	Gilson	FA10006M
Przedłuż mocowanie diamentowe z DAPI	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał P36962
Oczyszczony szczur przeciw myszom CD16/CD32	Becton Dickinson	553141
Królik anty-myszy CD3 (klon SP7)	Księga Abcam	ab16669
Królicza laminina anty-mysia	Księga Abcam	ab11575
Szczur anty-mysz ERT-R7	Księga Abcam	ab51824
Silnik RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Pikulka serologiczna, 1 ml	Firma VWR	357521
Pipeta serologiczna, 10 ml	Firma VWR	357551
Pipeta serologiczna, 5 ml	Firma VWR	357543
wodorotlenek sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S318-100
sacharoza	Chemia Fisher	Zobacz materiał S5-500
Nożyczki chirurgiczne	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14001-16
Nożyczki chirurgiczne, bardzo cienkie	Roboz powiedział:	Złącze RS-5882
Strzykawka, 10 ml	Becton Dickinson	302995
Strzykawka, 5 ml	Becton Dickinson	309646
Trypan niebieski	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15250-061

szt. powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: