Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie lampy o miękkim świetle (dzień 1)
- Użyj przezroczystej płyty akrylowej o grubości 0,3-0,5 cm w rozmiarze papieru A5. Wklej białe podkładki z przodu i z tyłu płyty akrylowej.
- Zainstaluj rząd białych świateł LED na krawędzi płyty, tak aby światła mogły wchodzić od strony płyty akrylowej, a następnie wystrzeliwać równolegle (Rysunek 1A-F, Rysunek 2B).
nuta: Ponieważ średnice EB we wczesnym stadium wynoszą od około 200 μm do 300 μm, trudno jest je wyraźnie zaobserwować gołym okiem pod świetlówką czystych ławek. W przeciwieństwie do tego, ze względu na wzmocnienie odbicia rozproszonego, możemy wyraźnie wykryć EB za pomocą bocznie oświetlonego miękkiego światła (Rysunek 2B, C). Płytka 6-dołkowa jest zalecana do hodowli EB w kolejnych eksperymentach. Jednak, aby lepiej pokazać efekt wizualny miękkiego światła, w tym badaniu czasami używa się naczyń do robienia zdjęć i nagrywania filmów zamiast talerzy, więc proszę nie zrozum mnie źle. Lampa z podświetlanym światłem miękkim może być również używana do płytki 6-dołkowej.
2. Transfer EB i wymiana podłoża (dni 2-5)
- Przygotuj nową 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności i dodaj 2 ml pożywki do tworzenia ciał zarodkowych (EB) do każdej studzienki.
- Usuń EB wraz z podłożem za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 1000 μl (patrz Tabela materiałów) i przenieś je na 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności (~100 EBs/dołek).
nuta: W procesie operacyjnym zastosowano lampę o miękkim świetle (wspomnianą w kroku 1), aby ułatwić obserwację EB. Wyłącz inne źródła światła w pomieszczeniach, aby poprawić efekt wizualny miękkiego światła.
- Zastępować taką samą objętością świeżej pożywki tworzącej EB każdego dnia. Użyj przepływu wtórnego, aby zebrać EB do środka i zmienić medium.
- Odessać starą pożywkę, pipetując powoli do krawędzi studzienki. Nie ssij zbyt mocno; w przeciwnym razie EB zostaną usunięte razem. Następnie dodaj świeże podłoże, aby ponownie zawiesić EBs.
nuta: Zasada przepływu wtórnego (rysunek 2D). Wywołaj przepływ wirowy, obracając czaszę po orbicie kołowej. Ze względu na przepływ wirowy indukowany jest przepływ wtórny i kierowany w stronę środka. EB lub organoidy zbiegają się do środka studni ze względu na wtórny przepływ generowany przez rotację, po którym można łatwo przeprowadzić zmianę podłoża lub transfer zarodka.
3. Indukcja neuronalna (dni 5-7)
- Przygotować nową 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności i dodać 3 ml pożywki do indukcji neuronalnej (Tabela 1) do każdej studzienki.
- Włącz boczne miękkie światło (wymienione w kroku 1) i wyłącz inne źródła światła w pomieszczeniach.
- Przenieś EB na 6-dołkową płytkę z dodatkiem pożywki do indukcji neuronalnej (~100 EB / dołek). Dodaj jak najmniej oryginalnego podłoża do nowego dołka.
nuta: Wprowadź proste umiejętności przenoszenia organoidów. Naturalnie, pod wpływem grawitacji i przy stosunkowo większej gęstości niż ośrodek, zawieszone EB będą stopniowo opadać, stosując operację pokazaną na rysunku 2E. Dzięki temu EB można wygodnie przenosić. Ponieważ, w porównaniu z EB, wolne komórki i martwe fragmenty komórek opadają wolniej, większość wolnych komórek i martwych fragmentów komórek można w ten sposób usunąć za pomocą tej metody sedymentacji (ryc. 2F).
- Próbki inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.
nuta: Pod mikroskopem średnica EB wynosiła około 500 μm, a krawędź była półprzezroczysta, co wskazuje, że utworzyła się warstwa neuronabłonkowa.
Tabela 1. Skład pożywki do indukcji neuronalnej
| Składniki | głośność |
| Zobacz materiał DMEM-F12 | 97 ml |
| Suplement N2 | 1 ml |
| Suplement diety Glutamax | 1 ml |
| MEM-NEAA | 1 ml |
| heparyna | Stężenie końcowe 1 μg/ml |
