1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i narzędzi
- Spryskaj ławkę i miejsce pracy 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
- Spryskaj narzędzia do preparacji, kleszcze i dwie szklane naczynia do zegarków 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na stole.
- Przygotować uzupełnioną pożywkę Schneidera (SSM, tabela 1) i umieścić ją na lodzie.
- Odpipetować 1 ml SSM do każdej ze szklanych naczyń zegarka.
- Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieś świeżo wyklute larwy z płytki PBS do SSM w pierwszym szklanym naczyniu do zegarka. Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieś świeżo wyklute larwy do SSM w drugim szklanym naczyniu do zegarka.
2. Sekcje i kultury mózgu
- Gdy larwy znajdą się w drugim szklanym naczyniu zegarkowym z SSM, wypreparuj mózgi z larw za pomocą kleszczy i mikroskopu preparacyjnego. Dostosuj powiększenie zgodnie z potrzebami.
- Użyj jednego kleszczyka, aby chwycić haczyki do ust, a drugim delikatnie chwyć ciało do połowy i pociągnij w przeciwnym kierunku (ryc. 1), aby podzielić larwę na dwie części.
nuta: Mózg będzie zlokalizowany tuż za haczykami ustnymi. Należy pamiętać, że wokół mózgu mogą znajdować się inne tkanki. Zachowaj ostrożność podczas usuwania tych tkanek, ponieważ może to spowodować uszkodzenie mózgu.
- Po wypreparowaniu 15-20 mózgów dodaj 1 ml SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej tacki hodowlanej. Przenieś świeżo wypreparowane mózgi do SSM za pomocą mikropipety i sterylnej końcówki (ryc. 2A).
- Umieścić mózgi w pożywce SSM w 12-dołkowej tacce hodowlanej w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 24 godziny (ryc. 2A).
Tabela 1: Przepis na wykonanie uzupełnionych mediów Schneidera (SSM). W tabeli podano objętość wszystkich składników potrzebnych do przygotowania 5 ml SSM.
| Składnik (stężenie początkowe) | Aby zrobić 5 ml | Końcowe stężenie |
| Drosophila media Schneidera | 3,89 ml | |
| Surowica bydlęca płodu (100%) | 500 μL< | 10% |
| Glutamina (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| Penicylina (5000 jednostek/ml), streptomycyna (50 000 μg/ml) | 100 μL | Wstrzykiwacz 1000 U/ml, paciorkowiec 1 mg/ml |
| Insulina (10 mg/ml) | 10 μL | 0,02 mg/ml |
| glutation (50 mg/ml) | 5 μL | 0,05 mg/ml |
| W sterylnym kapturze, używając sterylnej techniki, dodaj wszystkie składniki razem do stożkowej probówki o pojemności 14 ml. Umieść go na lodzie do czasu użycia. |
