Izolowanie mysich pierwotnych oligodendrocytów za pomocą kulek immunomagnetycznych

Streszczenie

Źródło: Flores-Obando, R. E. et al., Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje metodę izolowania pierwotnych komórek oligodendrocytów z zawiesiny komórek nerwowych uzyskanej od mysiego szczeniaka za pomocą separacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami specyficznymi dla antygenów oligodendrocytów, co umożliwia selektywną izolację tych komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Dysocjacja kory mózgowej myszy

1. Poświęć 5-7-dniowe młode myszy C57Bl/6N po urodzeniu przez szybkie ścięcie głowy nożyczkami uprzednio oczyszczonymi w 70% etanolu.
   nuta: Do każdego preparatu użyto kory mózgowej od 5-6 nowonarodzonych młodych myszy. Średnio jeden mózg myszy daje 1-1,5 x 10⁶ pierwszorzędowych oligodendrocytów (Ols).
2. Przetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej małymi nożyczkami preparacyjnymi i cofnij się, aby odsłonić czaszkę.
3. Ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu w tylnej części czaszki w kierunku obszaru czołowego, podnosząc nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Następnie, korzystając z otworu w tylnej części czaszki, przeciąć w kierunku każdego oczodołu wzdłuż podstawy czaszki.
4. Użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie odsunąć korę mózgowia od śródmózgowia i przenieś je do 60-milimetrowej naczynia do hodowli tkankowej zawierającej 7 ml B27NBMA. Powtórz kroki od 2.2 do 2.4 dla każdego mózgu, łącząc wypreparowaną korę mózgową.
5. Przenieś korę do nowego 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 5 ml buforu dysocjacyjnego (B27NBMA, 20-30 U/ml papainy i 2,500 U DNazy I).
6. Korę należy pokroić w kostkę na małe kawałki o wielkości około 1 mm³ za pomocą ostrza skalpela #15 i inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO_{2 ).}
7. Dodać 1 ml surowicy wzrostu bydła (BGS), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
8. Przenieść korę wraz z pożywką dysocjacyjną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
9. Delikatnie rozpocznij dysocjację tkanki mózgowej, powoli pipetując w górę i w dół 6-8 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, zwracając uwagę na zminimalizowanie pęcherzyków.
10. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez 2-3 minuty i przenieś supernatant do świeżej probówki.
11. Dodać 3 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/2500 U DNazy I do osadu tkankowego.
12. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby delikatnie zdysocjować tkankę mózgową podczas pipetowania w górę i w dół 6-8 razy. Uważaj, aby zminimalizować bąbelki.
13. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez 2-3 minuty.
14. Przenieść supernatant do świeżej probówki. Dodać 3 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/DNazy I do osadu tkankowego.
15. Delikatnie rozdzielić tkankę mózgową za pomocą końcówki do pipety P1000, jednocześnie pipetując mieszaninę pożywki i tkanki mózgowej w górę iw dół. Powtarzać kroki 2.13 i 2.14 do momentu, gdy nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki lub do wyczerpania B27NBMA zawierających 10% BGS/DNazy I, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Uważaj, aby zminimalizować bąbelki.
16. Zawiesina komórek basenowych z poprzednimi supernatantami.
17. Umieść sitko o średnicy 70 μm w probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie przepuścić zawiesinę komórek zebranych w puli przez sitko o wielkości 70 μm.
18. Przemyć sitko do komórek, dodając 1 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/DNazy I.
19. Wyrzuć sitko do komórek. Doprowadzić objętość do 30 ml za pomocą B27NBMA zawierających 10% BGS/DNazy I.
20. Przenieść zawiesinę komórek do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 200 x g.
21. Usunąć supernatant bez pozostawiania komórek wystawionych na działanie powietrza. Supernatant będzie mętny z powodu resztek komórkowych. Do granulki dodać 3 ml B27NBMA zawierającego 10% BGS.
22. Ostrożnie oddzielić osad komórkowy za pomocą pipety P1000. Doprowadzić objętość do 15 ml za pomocą B27NBMA zawierającej 10% BGS.
23. Przepuścić zawiesinę komórek przez świeże sitko o wielkości 40 μm.
24. Umyj sitko do komórek, dodając 1 ml B27NBMA zawierającego 10% BGS. Wyrzuć sitko do komórek.
25. Doprowadzić objętość do 30 ml za pomocą B27NBMA zawierających 10% BGS.
26. Przenieść zawiesinę komórek do 2 stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 200 x g.
27. Usunąć większość supernatantu, nie pozostawiając komórek wystawionych na działanie powietrza. Ponownie zawiesić granulki komórek w 5 ml lodowatego bufora do magnetycznego sortowania komórek (MCS).

2. Określanie liczby komórek i żywotności

1. Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny komórek w 400 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać rozcieńczenie 1:5 w 0,4% (w/v).
2. Wyśrodkuj szklankę nakrywkową nad komorą hemocytometru i napełnij dwie komory 10 μl rozcieńczenia komórek za pomocą pipety P10, unikając przepełnienia. Roztwór przejdzie pod szkłem nakrywkowym przez działanie kapilarne.
3. Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą 40-krotnego powiększenia.
   UWAGA: Zliczanie komórek jest rejestrowane za pomocą ręcznego licznika w każdym z pięciu kwadratów (cztery rogi i jeden środek). Tylko komórki niezdolne do życia wchłaniają barwnik i wydają się niebieskie, podczas gdy żywe i zdrowe komórki wydają się okrągłe i załamują i nie wchłaniają barwnika o niebieskim kolorze, co pozwala na określenie liczby żywotnych i całkowitych komórek na mililitr.

3. Izolacja oligodendrocytów O4⁺

1. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 10 min.
2. Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą aspiracji próżniowej, unikając wystawienia komórek na działanie powietrza.
3. Zawiesić osad w 90 μl buforu MCS na 1 x^{10 7} komórek ogółem, a następnie dodać 10 μl kulek anty-O4 na 1 x 10⁷ komórek.
4. Wymieszaj zawiesinę komórek i kulki, delikatnie przesuwając stożkową probówkę o pojemności 15 ml palcem 4-5 razy.
5. Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 4 °C, przesuwając palcem stożkową probówkę o pojemności 15 ml 4-5 razy co 5 minut co 5 minut.
6. Przemyj mieszankę, delikatnie dodając 2 ml buforu MCS na 1 x 10⁷ komórek do probówki. Odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 10 minut.
7. Odrzucić supernatant ostrożnie za pomocą aspiracji próżniowej, unikając wystawienia komórek na działanie powietrza. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MCS na każde 1 x^{10 7} komórek.
8. Przymocuj separator magnetyczny do stojaka separatora magnetycznego. Przymocuj kolumnę selekcyjną do separatora magnetycznego i umieść sitko o pojemności 40 μm na górze kolumny. Umieść dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml lub jedną stożkową o pojemności 50 ml poniżej kolumny separacyjnej, aby zebrać przepływ.
9. Wstępnie przepłukać sitko komórkowe o średnicy 40 μm i kolumnę separacyjną 3 ml buforu MCS i pozostawić bufor przez kolumnę, nie dopuszczając do jej wyschnięcia.
10. Dodaj mieszaninę zawiesiny komórek i kulek do sitka do komórek i do kolumny wyboru.
11. Przemyć sitko o długości 40 μm 1 ml buforu MCS.
12. Wyrzuć sitko do komórek i pozwól, aby mieszanina komórek, kulek i buforu przepłynęła przez kolumnę, nie dopuszczając do jej wyschnięcia.
13. Przemyć kolumnę separacyjną 3 razy 3 ml buforu MCS i 1 raz pożywką proliferacyjną OL.
14. Wyjmij kolumnę separacyjną z separatora magnetycznego, szybko umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i natychmiast dodaj 5 ml pożywki proliferacyjnej OL.
15. Umieść tłok na górze kolumny i mocno dociśnij, aby wypłukać oznaczone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
16. Usunąć 100 μl zawiesiny komórek w celu określenia liczby komórek i żywotności za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru, jak wskazano w sekcji 3.
    UWAGA: Żywotność komórek powyżej 80% jest uważana za dopuszczalną do kontynuowania hodowli OL, ale żywotność większa niż 90% jest optymalna.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 ml pipet serologicznych	Fisher Naukowy	13-676-10J
Końcówka strzykawki Luer-Loc o pojemności 10 ml	BD, Becton Dickinson	309604
Probówki stożkowe 15 ml	sokół	352097
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	sokół	353935
Sitko komórkowe 40μm	Fisher Naukowy	22368547
Probówki stożkowe 50 ml	sokół	352098
5 ml pipety serologiczne	Fisher Naukowy	13-676-10H
Płytki do hodowli tkankowych 60 mm	sokół	353002
Sitko komórkowe 70 μm	Fisher Naukowy	22363548
Koraliki anty-O4- Anty-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Kompletny zespół filtra butelkowego Autofil, filtr 0,22um, 250 ml	USA Naukowe	Nr kat. 6032-1101
Kompletny zespół filtra butelkowego Autofil, filtr 0,22um, 250 ml	USA Naukowe	6032-1102
Suplement B27	Invitrogen	Numer katalogowy: 17504-044
Surowica wzrostu bydła (BGS)	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH30541.03
Bsa	Fisher Naukowy	BP-1600-100
Kanał CNTF	Peprotech	Rejon 450-50
Dezoksyrybonukleaza I (DNAza I)	Worthington	LS002007
Edta	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S311
Skalpele jednorazowe z piór	Andwin Naukowy	EF7281C
glukoza	Fisher Naukowy	Zobacz materiał D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	Numer katalogowy: 35050-61
insulina	Invitrogen	Numer katalogowy: 12585-014
Stojak na separator magnetyczny - MACS multistand	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-303
Separator magnetyczny - separator MiniMACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-302
Jednostka filtrująca Millex PES 0,22 μm	Milipory	SLG033RS
Podłoże nerwowo-podstawne A	Invitrogen	Numer katalogowy 10888-022
papaina	Worthington	LS003126
PBS bez Ca2+ i Mg2+	Sigma	Zobacz materiał D5652
Roztwór podstawowy DNazy I			1. Rozpuścić w 12 500 j. Deoksyrybonukleaza I / ml w HBSS schłodzony na lodzie. 2. Sterylizuj filtr na lodzie 3. Podwielokrotność w ilości 200 μl i zamrozić przez noc w temperaturze -20 °C. 4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze od -20 do -30°C.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (bez Ca2+ i Mg2+)			Rozpuść saszetkę w 1 litrze wody, aby uzyskać 1 litr pożywki przy 9,6 grama proszku na litr pożywki. Przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
Roztwór błękitu trypanowego	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487,75 ml pożywki neurobazalnej A; 10 ml suplementu B27; 1 ml Primocin; 1,25 ml Glutamax; Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
B27NBMA + 10% BGS			27 ml B27NBMA; 3 ml surowicy wzrostu bydła
Podstawowy roztwór CNTF (10 μg/ml; 1000X)			Zamów w Peprotech (450-50). Uzupełnić w roztworze buforowym (np. DPBS + 0,2% BSA) w stężeniu 0,1 do 1 mg/ml zgodnie z instrukcją producenta (może się różnić w zależności od partii). Przechowywać w temperaturze -80 °C. Roztwór roboczy (10 μg/ml, 1000X) 1. Sporządzić na 0,2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem. 2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego podwielokrotności do 10 μg / ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS. 3. Podwielokrotność (20 μl / probówka) i szybkie zamrożenie w ciekłym azocie. 4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
Bufor do magnetycznego sortowania komórek (MCS)			Przygotować roztwór zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,2 i 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 mM EDTA, 5 μg/ml insuliny, 1 g/l glukozy. Sterylizować i odgazowywać bufor poprzez filtrację, przepuszczając go przez filtr Millex 0,22 μm. Przechowywać bufor w temperaturze 4°C do czasu użycia
Zrównoważone sole Hanka (HBSS) (Sigma			1. Odmierz 900 ml wody (o temperaturze 15-20 °C) do cylindra i delikatnie wymieszaj. 2. Dodaj moc i mieszaj, aż się rozpuści. 3. Wypłucz oryginalne opakowanie niewielką ilością wody, aby usunąć wszelkie ślady proszku. 4. Dodaj do roztworu w kroku 2. 5. Dodaj 0,35 g wodorowęglanu sodu (7,5% w/v) na każdy litr końcowej objętości. 6. Mieszaj aż do rozpuszczenia. 7. Dostosuj pH buforu, mieszając do 0,1-0,3 jednostki poniżej pH = 7,4, ponieważ może wzrosnąć podczas filtracji. W celu regulacji pH zaleca się stosowanie 1N HCl lub 1N NaOH 8. Dodaj więcej wody, aby doprowadzić końcową objętość do 1 l < br / > 9. Sterylizuj przez filtrację przy użyciu membrany o porowatości 0,22 mikrona. 10. Przechowywać w temperaturze 2-8 °C.