Przygotowanie mikrowzoru podłoża do badania fenotypów komórek Schwanna

Streszczenie

Źródło: Xu, Z., Orkwis, et al. Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej do oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna. J. Vis. Exp. (2020).

Film opisuje przygotowanie mikrowzoru podłoża do badania specyfikacji fenotypu komórki. Powlekany białkiem stempel PDMS z mikrowzorem służy do przenoszenia mikrowzoru na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDMS. Szkiełko nakrywkowe jest następnie traktowane środkiem powierzchniowo czynnym, aby utrudnić przyleganie komórek do niepożądanych powierzchni. Komórki są następnie dodawane, aby osiąść we wzorze i inkubowane w celu dalszej analizy.

Protokół

1. Przygotowanie i charakterystyka substratu do hodowli komórkowych

1. Przygotowanie podłoża
   1. Wymieszać elastomer bazowy polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacze za pomocą końcówki pipety energicznie w stosunku od 10:1 do 60:1, aż pęcherzyki zostaną jednorodnie rozproszone w mieszaninie. Usuń bąbelki za pomocą suszenia próżniowego, aż bąbelki się rozproszą.
      UWAGA: Podczas polimeryzacji PDMS utwardzacz sieciuje się z elastomerem bazowym, aby zapewnić pożądane właściwości mechaniczne końcowego polimeru. Współczynniki usieciowania można dostosować, aby zmienić sztywność PDMS.
   2. Umieść kroplę (~0,2 ml) wysuszonej mieszaniny PDMS na kwadratowym lub okrągłym szkiełku nakrywkowym (np. 22 mm x 22 mm) i obracaj szkiełko nakrywkowe na powlekarce wirowej z prędkością 2500 obr./min przez 30 s.
   3. Szkiełko nakrywkowe inkubować w piecu w temperaturze 60 °C przez 1-2 godziny lub w temperaturze pokojowej przez noc, aby PDMS stężał.
   4. Szkiełko nakrywkowe należy traktować środkiem czyszczącym UV-Ozone przez 7 minut (długość fali UV: 185 nm i 254 nm), aby zwiększyć hydrofilowość powierzchni. Umieść go w wysterylizowanej płytce 6-dołkowej.
   5. Przed użyciem do hodowli komórkowej inkubuj substraty w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut.
      UWAGA: Środek czyszczący UV-Ozone może wytwarzać ozon, który jest szkodliwy dla ludzi. Pracuj w dygestoriach chemicznych lub z jakąś formą wentylacji.
2. Przygotowanie podłoża z mikrowzorem
   1. Narysuj żądaną geometrię i obszary klejenia komórek (900 μm², 1 600 μm² i 2 500 μm²) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Utwórz chromowaną fotomaskę na podstawie tych wzorów od komercyjnego dostawcy.
   2. W pomieszczeniu czystym lub środowisku wolnym od kurzu należy używać standardowych technik fotolitografii do wytwarzania płytek krzemowych. Parametry krytyczne dla tego konkretnego zastosowania są następujące: Fotorezystor: SU-8 2010; Profil wirowania w celu rozproszenia fotorezystu: 500 obr/min przez 10 s z przyspieszeniem 100 obr/min, następnie 3500 obr/min przez 30 s z przyspieszeniem 300 obr/s; Energia ekspozycji światła UV: 130 mJ / cm2,
      UWAGA: Wysokość wzorów na płytkach krzemowych wynosi około 10 μm przy tych parametrach. Potencjalne pęknięcia wokół krawędzi poza prostokątnymi lub trójkątnymi wzorami można zobaczyć za pomocą mikroskopu świetlnego po kroku 1.2.2. Pieczenie wafla silikonowego w temperaturze 190 °C przez 30 minut pomaga wyeliminować pęknięcia.
   3. Umieścić wzorzystą płytkę krzemową w okrągłej szalce Petriego o średnicy 150 mm x wysokości 15 mm i wlać odgazowany PDMS (proporcje mieszania 10:1) przygotowane w kroku 1.1.1 na płytkę krzemową.
      UWAGA: Upewnij się, że grubość PDMS wynosi co najmniej 5 mm, aby ułatwić obsługę podczas etapów drukowania mikrokontaktowego.
   4. Zestalić PDMS na płytce krzemowej w piecu w temperaturze 60 °C przez noc. Poczekaj, aż PDMS ostygnie do temperatury pokojowej. Precyzyjnie wytnij stemple kwadratowe o wymiarach 30 mm x 30 mm zawierające prawidłowe wzory z płytki krzemowej za pomocą skalpela chirurgicznego. Nie uszkadzaj wafla silikonowego.
      UWAGA: W tym momencie wafle krzemowe mogą być wielokrotnie używane do produkcji większej liczby znaczków po oczyszczeniu izopropanolem.
   5. Wysterylizuj stempele PDMS i przestrajalne szkiełka nakrywkowe (przygotowane w krokach od 1.1.1 do 1.1.3), zanurzając je w 70% etanolu na 30 minut.
   6. Aby potwierdzić skuteczność mikrowzoru za pomocą stempli PDMS po wydrukowaniu mikrokontaktowym, należy osuszyć powierzchnię stempli PDMS za pomocą przefiltrowanego strumienia powietrza i odpipetować 50 μg/ml roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (sprzężonej z czerwienią teksańską), aby pokryć całą wzorzystą stronę stempla PDMS.
   7. Inkubować stemplowanie PDMS z roztworem BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję białek.
   8. Osuszyć powierzchnię przestrajalnych szkiełek nakrywkowych za pomocą przefiltrowanego strumienia powietrza i zwiększyć hydrofilowość powierzchni, jak opisano w kroku 1.1.5.
   9. Wysuszyć na powietrzu stemple PDMS, aby usunąć pozostały roztwór BSA.
      UWAGA: Należy upewnić się, że roztwór BSA został całkowicie usunięty ze stempla, ponieważ wszelkie pozostałe roztwory spowodują przesuwanie się stempli na szkiełku nakrywkowym podczas drukowania mikrokontaktowego.
   10. Doprowadzić wzorzystą stronę stempla do konforemnego kontaktu z przestrajalnym szkiełkiem nakrywkowym w celu adsorpcji BSA na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Delikatnie dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego przez 5 minut
       UWAGA: Nie należy wywierać nadmiernej siły na stempel, ponieważ wygina się on i powoduje niespecyficzny kontakt między stemplem a szkiełkiem nakrywkowym. Odpowiednia siła przyłożona do stempla jest niezbędna do udanego druku mikrokontaktowego.
   11. Zbadaj mikrowzór za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC (izotiocyjanian fluoresceiny).
   12. Aby wydrukować obszary adhezji komórkowej, a nie wzory fluorescencyjne, zastąp białko BSA lamininą i powtórz kroki od 1.2.5 do 1.2.10.
   13. Usunąć stempele z szkiełek nakrywkowych i przenieść szkiełka nakrywkowe do wysterylizowanej płytki 6-dołkowej. Dodać 2 ml 0,2% w/v roztworu Pluronic F-127 do każdej studzienki, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
       UWAGA: Pluronic F-127 może być adsorbowany na powierzchni PDMS, zwiększając hydrofobowość powierzchni PDMS, aby zablokować adhezję komórek.
   14. Odessać roztwór Pluronic F-127 i przemyć 5x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i 1x pożywką do hodowli komórkowych przed wysiewem komórek. Typowa gęstość wysiewu dla SC wynosi 1 000 komórek/^cm2.
   15. 45 minut po wysiewie komórek usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć szkiełka nakrywkowe PBS 2x, aby zapobiec przyleganiu wielu SC do tego samego wzoru. Utrzymuj komórki w pożądanym środowisku hodowli komórkowej przez 48 godzin przed oznaczaniem ilościowym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA), koniugat Texas Red	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A23017	Barwienie BSA w celu uwidocznienia mikrowzorów
Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco Medium	Thermo Fisher Naukowy	11965092	Pożywka do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fisher Naukowy	16000044	Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
Fibronektyna	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 33010-018	Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon	Zaćmienie Ti2	Mikroskop fluorescencyjny
Laminina	Thermo Fisher Naukowy	23017015	Białko używane do powlekania szkiełek nakrywkowych
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Naukowy	15140122	Pożywka do hodowli komórkowych uzupełniająca
Ślusarski F-127	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P-2443	Blokuj niespecyficzne wiązanie białek
SYLGARD 184 PDMS baza i utwardzacz	Sigma Aldrich	761036	Przestrajalny polimer stosowany do powlekania szkiełek nakrywkowych
Środek do czyszczenia UV-Ozone	Skaner Novascan		Zwiększenie hydrofiozyjności PDMS