Izolacja komórek Schwanna z korzeni rdzeniowych myszy

Streszczenie

Źródło: He, Q., et al., & Ding, F. Oczyszczanie fibroblastów i komórek Schwanna z nerwów czuciowych i ruchowych in vitro. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia izolację i hodowlę komórek Schwanna z korzeni rdzeniowych myszy. Wyizolowane komórki są następnie hodowane w określonych pożywkach. Komórki Schwanna są izolowane poprzez zróżnicowane trawienie i przyleganie. Następnie są przenoszone do szkiełek nakrywkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową w celu przyczepienia i proliferacji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja i hodowla fibroblastów nerwów ruchowych i czuciowych oraz SC (komórki Schwanna)

1. Użyj siedmiodniowych szczurów Sprague-Dawley (SD) (n=4) z Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Nantong w Chinach. Umieść szczury w zbiorniku zawierającym 5% izofluranu na 2-3 minuty, pozwól zwierzętom oddychać powoli i nie mieć samodzielnej aktywności, a następnie zdezynfekuj je przy użyciu 75% etanolu przed dekapitacją.
2. Za pomocą nożyczek przeciąć tylną skórę na około 3 cm i usunąć kręgosłup. Ostrożnie otwórz kanał kręgowy, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
3. Utrzymuj rdzeń kręgowy na szalce Petriego o średnicy 60 mm z 2-3 ml lodowatego roztworu soli D-Hanksa (HBSS).
4. Na podstawie budowy anatomicznej wyciąć korzeń brzuszny (nerw ruchowy), a następnie korzeń grzbietowy (nerw czuciowy) pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie umieść je w lodowatym zrównoważonym roztworze soli D-Hanksa (HBSS).
5. Po usunięciu HBSS pokrój nerwy na 3-5 mm kawałki nożyczkami i trawij 1 ml 0,25% (w/v) trypsyny w temperaturze 37 °C przez 18-20 minut. Następnie uzupełnij 3-4 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zatrzymać trawienie.
6. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół około dziesięć razy i odwirowywać przy 800 x g przez 5 minut. Następnie wyrzuć supernatant i zawiesij osad w 2-3 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS.
7. Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą filtra o siatce 400, a następnie zaszczepić komórki na szalce Petriego o średnicy 60 mm i wyhodować w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Po 4-5 dniach hodowli wyizoluj fibroblasty pasażowe 0 (p0) i SC po osiągnięciu 90% konfluencji.
8. Izolacja i hodowla SC (ryc. 1)
   1. Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS. Dodać 1 ml 0,25% (w/v) trypsyny (37 °C) na 60 mm szalkę Petriego, aby trawić komórki przez 8-10 s w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 3 ml DMEM uzupełnione 10% FBS, aby zatrzymać trawienie.
   2. Delikatnie przedmuchaj mieszaninę pipetą, aby odłączyć SC. Następnie zebrać i odwirować SC przy 800 x g przez 5 minut.
   3. Odrzucić supernatant i zawiesić pozostałość w 3 ml DMEM z 10% FBS, 1% penicyliną/streptomycyną, 2 μM forskoliną i 10 ng/ml HRG, a następnie zaszczepić komórki na niepowlekanej szalce Petriego o średnicy 60 mm. Po hodowli w temperaturze 37 °C przez 30-45 minut, fibroblasty (kilka fibroblastów jest trawionych za pomocą SC) przyczepiają się do dna naczynia.
   4. Przenieść supernatant (łącznie z SC) do innego powlekanego poli-L-lizyny (PLL) pożywki i kultury w temperaturze 37 °C przez 2 dni.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat ideowy przedstawiający etapy separacji i oczyszczania fibroblastów sensorycznych i motorycznych oraz SC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zrównoważony roztwór soli D-Hanka	Gibco (firma Gibco)	14170112
DMEM (DMEM)	Corning	10-013-CV
Mikroskop preparacyjny	Olympus	SZ2-ILST
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Gibco (firma Gibco)	10099-141C
Forskolina	Sigma	F6886-10MG
0,25% (m/v) trypsyna	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 25200-072
Potrawy kulturowe
Probówki wirówkowe
Szkiełka nakrywkowe
Poli-L-lizyna
Inkubator CO2