1. Przygotowanie hodowli śródbłonka myszy w przepuszczalnych wkładkach podporowych
UWAGA: Komórki BEND3 są utrzymywane zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przygotuj pożywkę komórkową BEND3 (BM), dodając 50 ml FBS i 5 ml penicyliny-streptomycyny do 500 ml DMEM i dobrze wymieszaj.
- Odessać pożywkę z naczynia i przemyć kulturę komórkową BEND3 1 ml PBS jeden raz. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) do komórek i inkubować je przez 4 minuty w temperaturze 37 °C.
- Dodaj 1 ml BM do komórek, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie dysocjować komórki. Przenieść zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadu przez odwirowanie w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut przy 400 x g.
- Odessać supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki za pomocą 9 ml świeżego BM, a następnie dodać 1 ml zawiesiny komórek do jednej przepuszczalnej wkładki nośnej. Dodać kolejne 2 ml świeżego BM na studzienkę w dolnej komorze matrycy. Kontynuuj hodowlę komórek przez jeden dzień.
2. Konfiguracja kokultury neuronalno-śródbłonkowej i systemu znakowania Ac4ManNAz
- Pewnego dnia, po posianiu komórek BEND3 we wkładach, należy delikatnie zassać najpierw pożywkę w dolnej komorze, a następnie wkładki. Umyj powierzchnię wkładów 3 razy wstępnie podgrzanym DMEM (zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco). Umyj zewnętrzną powierzchnię wkładów, spłukując je wstępnie podgrzanym DMEM.
- Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego AM (pożywki przylegającej) do jednej wkładki, a następnie przenieś wkładki do studzienek z pierwotnymi komórkami korowymi. Inkubować kokulturę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 12 godzin.
- Rozpuścić Ac4ManNAz w DMSO (sultlenek dimetylu) do uzyskania stężenia podstawowego 200 mM. 12 godzin po założeniu kokultury nerwowo-śródbłonkowej dodać 1 μl materiału Ac4ManNAz na dolną komorę i 0,5 μl osadu na wkładkę do kokultury. Natychmiast i delikatnie wstrząśnij talerzami, aby dobrze wymieszać podłoże. W przypadku komórek kontrolnych dodaj równą objętość DMSO.
- Hodować komórki przez kolejne 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przygotuj AM z 10x bFGF jako pożywką do ponownego karmienia (RM). W tym czasie dodaj 100 μl RM na wkładkę i 200 μl RM na dolną komorę, aby co drugi dzień dokarmiać komórki śródbłonka i nerwowe. Podczas ponownego karmienia nie należy dostarczać Ac4ManNAz ani DMSO do hodowli.
