Przygotowanie śródbłonka mózgowego z tętniczek miąższowych myszy

Streszczenie

Źródło: Hakim, M. A., et al., Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje metodę izolowania przewodów śródbłonkowych od miąższu mózgu myszy. Dzięki połączeniu trawienia enzymatycznego i dysocjacji mechanicznej, proces ten daje nienaruszoną rurkę z komórkami śródbłonka.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Rozwiązania i leki

1. Fizjologiczny roztwór soli (PSS)
   1. Przygotować co najmniej 1 l PSS przy użyciu 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) i 10 mM glukozy.
   2. Przygotować niezbędne roztwory bez CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) do wypreparowania tętniczek mózgowych i izolacji rurki śródbłonkowej.
      nuta: Przygotować wszystkie roztwory w ultraczystym dejonizowanym H2O, a następnie przeprowadzić filtrację (0,22 μm). Upewnij się, że produkt końcowy ma pH 7,4 i osmolalność między 290 a 300 mOsm.
2. Albumina surowicy bydlęcej (BSA, 10%)
   1. Rozpuścić 1 g liofilizowanego proszku BSA w zlewce o pojemności 10 ml o zerowym Ca²⁺ PSS. Przykryj zlewkę i odczekaj co najmniej 2 godziny, powoli mieszając, aż BSA się rozpuści.
   2. Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm i przygotować 1 ml porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
3. Roztwór do rozwarstwiania
   1. Dodaj 500 μl BSA (10%) do 49,5 ml zero Ca²⁺ PSS, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml.
   2. Przenieś roztwór na szalkę Petriego w celu rozwarstwienia tętniczek.
4. Rozwiązanie do dysocjacji
   1. Dodać 5 μl roztworu CaCl₂ (1 M) i 500 μl BSA (10%) do 49,5 ml zerowego Ca²⁺ PSS, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
5. enzymy
   1. Przygotuj 1 ml roztworu wytrawiającego ze 100 μg/ml papainy, 170 μg/ml ditioerytrytolu, 250 μg/ml kolagenazy (mieszanka typu H) i 40 μg/ml elastazy.
      nuta: Aktywność enzymów może się różnić, chociaż skuteczne protokoły będą prawdopodobnie wymagały następujących działań enzymatycznych: ≥ 10 jednostek/mg dla papainy, ≥ 1 jednostka/mg dla kolagenazy i ≥ 5 jednostek/mg dla elastazy.
       

2. Izolacja tętniczek miąższowych

UWAGA: Tętniczki wywodzące się ze środkowych tętnic mózgowych (MCA) i osadzone w miąższu mózgu są wybrane do tego protokołu. Tętniczki są izolowane zgodnie z wcześniejszym opisem11, z modyfikacją.

1. Użyj stalowych kołków (średnica: 0,2 mm, długość: 11 do 12 mm), aby zabezpieczyć izolowany mózg w zimnym roztworze preparacyjnym na szalce Petriego zawierającej powłokę z polimeru krzemowego nasączoną węglem drzewnym (głębokość ≥ 50 cm).
2. Za pomocą ostrych i wyrównanych nożyczek preparacyjnych wytnij prostokąt tkanki mózgowej (długość: 5 mm, szerokość: 3 mm) (ryc. 1B) wokół MCA, upewniając się, że górna część segmentu tkanki znajduje się poza punktem rozgałęzienia od koła Willisa. Wytnij kolejny prostokąt tkanki mózgowej z drugiej półkuli mózgu, aby w razie potrzeby uzyskać dostęp do większej liczby tętniczek.
3. Zabezpiecz oddzielony segment tkanki mózgowej w naczyniu z MCA skierowanym do góry (dystalnie od koła Willisa) za pomocą stalowych kołków (średnica: 0,1 mm, długość: 13 do 14 mm). Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie w pobliżu szpilek, aby usunąć pia za pomocą małych kleszczyków, delikatnie odrywając od jednego końca w kierunku drugiego (ryc. 1C). Usuń pia z drugiego segmentu tkanki, aby w razie potrzeby uzyskać dostęp do większej liczby tętniczek. Ostrożnie zabezpiecz izolowaną pia z tętniczkami miąższowymi rozgałęzionymi od MCA w naczyniu ze szpilkami i wypreparuj tętniczki miąższowe (ryc. 1D), upewniając się, że tętniczki nie są uszkodzone.
   nuta: Jeśli tętniczki nie są łatwe do wyrwania za pomocą pia z miąższu, użyj cienkich kleszczy i wbij się w mózg, zaczynając od punktu rozgałęzienia MCA od koła Willisa. Zlokalizuj tętniczkę, ostrożnie poluzuj tkankę wokół tętniczek (ryc. 1E) i delikatnie wyciągnij tętniczkę z miąższu, przytrzymując górny koniec tętniczki (ryc. 1F). Z jednego prostokąta tkanki mózgowej można wyizolować wiele tętniczek (długość: ~1,5-2 mm).
4. Upewnij się, że tętniczka jest czysta i nie ma do niej przyczepionej tkanki i odetnij wszelkie pozostałe dystalne gałęzie (ryc. 2A). Użyj tej czystej, nienaruszonej tętniczki do trawienia enzymatycznego. Alternatywnie, pokrój każdą tętniczkę na dwie części (długość: 0,75-1 mm) w celu trawienia enzymatycznego w celu przygotowania rurki śródbłonka, jeśli jest to pożądane.
    

3. Trawienie tętniczek miąższowych i przygotowanie rurki śródbłonka

1. Rozmieszczenie sprzętu i pipet
   nuta: Izolacja śródbłonka tętniczego od mózgu została opisana wcześniej13,18. Obecny protokół zawiera modyfikacje dotyczące izolacji śródbłonka z tętniczek miąższowych (śródmózgowych). Wiele tętniczek i/lub kawałków tętniczek może być używanych razem do trawienia enzymatycznego.
   1. Zmontuj aparat do rozcierania13 do przygotowania rurek śródbłonka za pomocą aluminiowego stolika podtrzymującego komorę i mikromanipulatorów. Zmontuj mikroskop wyposażony w obiektywy (5x-60x) i kamerę podłączoną do monitora komputera. Zabezpiecz mikrostrzykawkę ze sterownikiem pompy obok stolika i próbki.
   2. Umieścić pipetę do napełniania olejem mineralnym na tłoku mikrostrzykawki. Użyj mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy, aby pobrać roztwór dysocjacyjny do pipety do rozcierania (~130 nL) na wierzchu oleju mineralnego, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w pipecie.
2. Częściowe trawienie odcinków tętniczek
   1. Umieść nienaruszone segmenty tętniczek w 1 ml roztworu dysocjacyjnego w szklanej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 100 μg/ml papainy, 170 μg/ml ditioerytrytolu, 250 μg/ml kolagenazy i 40 μg/ml elastazy. Inkubować segmenty tętniczek w temperaturze 34 °C przez 10-12 minut.
   2. Po strawieniu zastąp roztwór enzymu 3-4 ml świeżego roztworu dysocjacyjnego o temperaturze pokojowej.
3. Izolacja śródbłonka tętniczki
   UWAGA: Po roztrawieniu i zastąpieniu roztworu enzymu, przenieść jeden lub wiele częściowo strawionych segmentów do roztworu dysocjacyjnego w komorze superfuzyjnej przymocowanej do ruchomej platformy. Podczas oglądania w powiększeniu od 100x do 200x wybierz jeden częściowo strawiony, ale nieuszkodzony segment naczynia i skup się na nim pod mikroskopem.
   1. Umieścić pipetę do rozcierania dołączoną do iniektora mikrostrzykawki w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca strawionego segmentu naczynia. Ustaw szybkość w zakresie 1-3 nL/s na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.
   2. Utrzymując powiększenie od 100x do 200x, wycofaj segment tętniczki do pipety, a następnie wysuń, aby dysocjować przydankę i komórki mięśni gładkich (ryc. 1B). Rozdziel segment naczynia, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną rozdzielone, a tylko komórki śródbłonka pozostaną jako nienaruszona "rurka"
      nuta: Jeśli to konieczne podczas rozcierania, ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę z rurki śródbłonka. Zazwyczaj tylko kilka cykli tarturacji daje nienaruszoną rurkę śródbłonka.
   3. Za pomocą mikromanipulatorów przymocuj każdy koniec rurki śródbłonka do szklanego szkiełka nakrywkowego w komorze za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego (Rysunek 2C,D).
4. Zabezpieczenie śródbłonka tętniczki
   1. Zastąp roztwór dysocjacyjny roztworem do superfuzji (PSS zawierającym 2 mM CaCl₂), upewniając się, że materiał nieśródbłonkowy został wypłukany z komory.
   2. Przenieś zabezpieczoną rurkę śródbłonka na platformie mobilnej do stanowiska mikroskopowego przeznaczonego do ciągłej superfuzji i wewnątrzkomórkowych lub fluorescencyjnych zapisów/obrazowania.
   3. Zastosuj ciągłe dostarczanie PSS podczas eksperymentu. Ręcznie ustaw natężenie przepływu (5-7 ml/min) przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą zaworu sterującego przepływem w linii, zgodnie z przepływem laminarnym, jednocześnie dopasowując dopływ przepływu roztworu do stopnia zasysania podciśnienia. Pozwól, aby ≥5 minuty przepływu PSS do komory w celu przefuzji rurki śródbłonka przed uzyskaniem danych tła i/lub załadowaniem barwnika.

Wyniki

Rycina 1: Rozwarstwienie i izolacja tętniczek miąższowych. (A) Izolowany mózg myszy z nienaruszonym Kręgiem Willisa. (B) Wycięty prostokątny fragment tkanki mózgowej zawierający MCA (biała strzałka). (C) Izolacja pia z górnej części tkanki (tętniczka, niebieska strzałka). (D) Tętniczki (oznaczone niebieskimi grotami strzałek) połączone ze środkowymi tętnicami mózgowymi (żółte strzałki). (E) Zidentyf...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chłodziarka do kąpieli (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Naukowy	13874647
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Pinning)	Instrumenty Warnera	G150T-6
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (ostre elektrody)	Instrumenty Warnera	GC100F-10
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Tryturacja)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	pozycji 1B100-4
BSA: Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7906
CaCl2: Chlorek wapnia	Sigma	223506
Kolagenaza (mieszanka typu H)	Sigma	Zobacz materiał C8051
Digitalizator pozyskiwania danych	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Digidata 1550A
Naczynie rozwarstwiające (szklane Petri z węglem drzewnym na dnie)	Oprzyrządowanie Żywych Systemów, St. Albans City, VT, Stany Zjednoczone	DD-90-S-BLK
Ditioerytrytol	Sigma	Zobacz materiał D8255
DMSO: Dimetylosulfotlenek	Sigma	Zobacz materiał D8418
Elastaza (trzustka świni)	Sigma	E7885
Zawór sterujący przepływem	Instrumenty Warnera	FR-50
Interfejs systemu fluorescencji, lampa ARC i zasilacz, hyperswitch i PMT	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Systemy IonOptix
Kleszcze (z cienką końcówką, zaostrzone)	Certyfikat FST	Dumont #5 i Dumont #55
glukoza	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	Kontroler G7021
HEPES: kwas (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)	Sigma	Zobacz materiał H4034
KCl: Chlorek potasu	Sigma	Zobacz materiał P9541
MgCl2: Chlorek magnezu	Sigma	Zobacz materiał M2670
Mikromanipulator	Siskiyou powiedział:	MX10
Ściągacz do mikropipet (cyfrowy)	Sutter Instruments, Novato, Kalifornia, Stany Zjednoczone	P-97 lub P-1000
Mikroskop (odwrócony przez firmę Nikon)	Nikon Instruments Inc., Melville, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał TS2
Mikroskop (odwrócony przez firmę Nikon)	Nikon Instruments Inc	Zaćmienie TS100
Stolik mikroskopowy (aluminiowy)	Siskiyou, Grants Pass, Oregon, Stany Zjednoczone	Rozdzielczość 8090P
Sterownik pompy mikrostrzykawkowej	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	SYS-MICRO4
NaCl: Chlorek sodu	Sigma	Zobacz materiał S7653
papaina	Sigma	Zobacz materiał P4762
Obiektywy z kontrastem fazowym	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X i 20X)
Nożyczki (ostrza 3 mm i 7 mm)	Fine Science Tools (lub FST), Foster City, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Moria MC52 i 15000-00
Nożyczki (styl Vannas; ostrza 9,5 mm i 3 mm)	Światowe instrumenty precyzyjne	555640S, 14364
Regulator temperatury (dwukanałowy)	Instrumenty Warnera	TC-344B lub C
Układ sterowania zaworem	Instrumenty Warnera	Zobacz materiał VC-6

powiedział: powiedział: powiedział: (wersja angielska) TGL