Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Rozwarstwienie krążka międzykręgowego bydła
- Dokładnie spłucz cały ogon wodą z kranu, aby usunąć brud i włosy z powierzchni.
nuta: W przypadku nienaruszonych, dystalnych końców, do eksperymentów można użyć maksymalnie 9 krążków międzykręgowych (IVD) (kość ogonowa 1-9) na ogon, w zależności od pożądanego rozmiaru IVD. Biorąc pod uwagę pożądaną średnicę w zakresie 15-20 mm, do eksperymentów użyliśmy 12 ogonów bydlęcych z 5 wykańczanymi wykańczalniami do diagnostyki in vitro na ogon.
- Zanurz cały ogon w pudełku zawierającym 1% roztwór betadyny na 10 minut. Krótko osusz ogon sterylną gazą i umieść go na sterylnym serwecie.
nuta: Podczas preparowania dysku należy nawilżyć ogony gazą zwilżoną roztworem Ringera, aby zapobiec odwodnieniu. Przechowuj ogony (lub pozostałe segmenty) owinięte w mokrą gazę, aż cała procedura preparowania zostanie zakończona.
- Za pomocą skalpela (nr 20) należy jak najdokładniej usunąć tkankę miękką z kręgosłupa ogonowego, aby ułatwić identyfikację wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro. Usuń wyrostki kolczyste i poprzeczne kręgów za pomocą szczypiec do usuwania kości.
nuta: Wybierz IVD o żądanej średnicy. W niniejszym badaniu zastosowano IVD o zakresie średnic 15-20 mm.
- Przetnij poprzecznie szczypcami do kości przez środek każdego trzonu kręgu, aby uzyskać poszczególne segmenty ruchu. Umieść ruchome segmenty na szalce Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera.
- Zlokalizuj IVD i kręg za pomocą badania palpacyjnego i delikatnego przesuwania segmentów ruchu. Wykonaj dwa równoległe nacięcia piłą taśmową w płytce wzrostowej IVD, po jednym z każdej strony IVD. Określić położenie płytki wzrostowej, dotykając i znajdując wypukłe miejsce kostnej części płytki końcowej (twardej) przylegającej do dysku (miękkiej) w bezpiecznej odległości około 0,5-1 mm od IVD w kierunku kręgu. Upewnij się, że ostrze piły taśmowej jest chłodzone roztworem Ringera podczas przecinania kręgów.
- Przenieść IVD na czystą szalkę Petriego z czystą gazą zwilżoną roztworem Ringera.
nuta: Gaza powinna być zwilżona i niezbyt mokra, aby zapobiec pęcznieniu wyrobów do diagnostyki in vitro,
- Użyj ostrza skalpela, aby zeskrobać trzon kręgu (czerwona/różowa kość), płytkę wzrostową (biała chrząstka), pozostaw nienaruszoną płytkę końcową (żółto-różową). Ustaw dwie powierzchnie płasko i równolegle do procedury ładowania. Zeskrobane wyroby do diagnostyki in vitro przenieść na świeżą szalkę Petriego z gazą zwilżoną roztworem Ringera.
nuta: Noś rękawicę z kolczugi, aby chronić dłoń podczas trzymania IVD i skrobania.
- Zmierz wysokość i średnicę tarczy za pomocą suwmiarki. Oczyść skrzepy krwi w kości kręgów roztworem Ringera za pomocą systemu płukania strumieniowego.
- Przenieś IVD do plastikowych probówek o pojemności 50 ml, po jednej IVD na probówkę. Dodać 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 10% penicyliny/streptomycyny (P/S) na IVD i pozostawić na 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant i dodać 10 ml PBS + 1% P/S na IVD przez 2 minuty, aby przepłukać IVD.
2. Kultura IVD i ładowanie
- Przenieść krążki do komór IVD i dodać pożywkę do hodowli IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM o wysokiej zawartości glukozy dla grupy fizjologicznej i 2 g/L DMEM o niskiej zawartości glukozy dla grupy patologicznej) + 1% P/S + 2% surowicy cielęcej płodu + 1% ITS (zawiera 5 μg/ml insuliny, 6 μg/ml transferyny, i 5 ng/ml kwasu selenowego) + 50 μg/ml 2-fosforanu askorbinianu + 1% aminokwasu endogennego + 50 μg/ml środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek pierwotnych) i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności 85% i 5% CO2 .
- Hoduj dyski przez 4 dni w systemie bioreaktora zgodnie z grupami eksperymentalnymi. W grupie patologicznej utrzymuj warunki obciążenia zwyrodnieniowego na poziomie 0,32-0,5 MPa, 5 Hz przez 2 godziny/dobę. W fizjologicznej grupie kontrolnej należy zastosować protokół obciążenia 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz przez 2 godziny/dzień.
nuta: Podczas procedur załadunku należy umieścić IVD w komorach zawierających 5 ml pożywki IVD. Objętość zależy od wielkości komór załadowczych bioreaktora. Pomiędzy procedurami ładowania umieścić IVD w sześciodołkowych płytkach z 7 ml pożywki do IVD w celu odzyskania swobodnego pęcznienia.
- W celu analizy zmian wysokości krążka w okresie eksperymentalnym, należy zmierzyć wysokość dysku suwmiarką po rozwarstwieniu IVD (linia wyjściowa), a następnie codziennie po okresie swobodnego pęcznienia i po obciążeniu dynamicznym przez czas trwania eksperymentu.
