Method Article

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Assetta, B., et al., Generacja ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Indukcja ludzkich neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Przygotowanie lentiwirusa (~5 dni, szczegółowy protokół jak opisano wcześniej)
    1. Płytka ~ 1 milion komórek HEK293T w każdej kolbie T75, aby zlewały się ~ 40% podczas wykonywania transfekcji. Transfekować je plazmidami eksprymującymi indukowany tetracykliną Ngn2 i gen oporny na puromycynę (PuroR; pod tą samą kontrolą promotora TetO), rtTA i trzema plazmidami pomocniczymi pRSV-REV, pMDLg / pRRE i VSV-G (12 μg DNA wektora lentiwirusowego i 6 μg każdego z DNA plazmidu pomocniczego). Przygotować co najmniej trzy kolby na preparat lentiwirusa. Użyj PEI do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Wymień nośnik po 16 godzinach i wyrzuć.
    2. Zbierz uwolnione cząsteczki wirusa, zbierając pożywki hodowlane codziennie i zastępując je świeżymi pożywkami przez 3 dni. Zebrać zebrane pożywki zawierające cząstki wirusa do oczyszczenia. Przefiltrować wirusa przez filtr 0,22 μm i odwirować przy 49 000 x g przez 90 minut. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości PBS-glukozy (~150 μL).
  2. Indukcja neuronów (~5 dni)
    nuta: Ten protokół indukcji (ryc. 1A; diagram przepływu) jest wysoce skuteczny zarówno w przypadku komórek iPS, jak i ES o zwalidowanej pluripotencji (którą można oznaczyć przez barwienie immunohistochemiczne dobrze scharakteryzowanych markerów pluripotencji; Rysunek 1B).
    1. Należy użyć dostępnych w handlu ludzkich komórek ES H1 w czasie 52 (patrz tabela materiałów). Hodować komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową pokrytych roztworem (~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową; patrz Tabela Materiałów) przy użyciu pożywki do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. W dniu -2 odłączyć komórki ES (80% zlewające się) z 1 ml roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść komórki do probówki; umyć studzienkę 2 ml pożywki i połączyć w tej samej probówce. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce i umieścić komórki na pokrytych matrycą płytkach 6-dołkowych o gęstości wysiewu 1 x 105 komórek na studzienkę.
    3. W dniu -1 dodać lentiwirusy eksprymujące Ngn2 plus PuroR i rtTA wraz z polibrenem (8 μg/ml) do komórek ES w świeżej pożywce podtrzymującej komórki ES (patrz tabela materiałów). Dokładna ilość wirusów powinna być określona na podstawie rzeczywistych mian lub miareczkowania. Zazwyczaj dodajemy 5 μl każdego wirusa na studzienkę do płytki 6-dołkowej.
    4. W dniu 0 dodać Doksycyklinę (2 μg/ml w celu aktywacji ekspresji Ngn2) w pożywce DMEM-F12 z suplementem N2 bez morfogenów.
    5. W dniu 1 dodać Puromycynę do świeżej pożywki DMEM-F12 plus N2 i doksycykliny, do końcowego stężenia 1 μg/ml pożywki. Selekcjonować transdukowane komórki w Puromycynie przez co najmniej 24 godziny. Wyższe stężenie puromycyny (do 5 μg/ml) i dłuższy okres selekcji (do 48 godzin) mogą być wymagane w celu odpowiedniego usunięcia niedostatecznie transdukowanych komórek, jeśli miano wirusa jest niskie.
    6. W dniu 2 odłącz różnicujące neurony roztworem do odłączania komórek (patrz Tabela materiałów), ponownie pokryj je na 24-dołkowych płytkach (między 80 000-200 000 komórek / dołek) pokrytych roztworem matrycy (patrz Tabela materiałów) i utrzymuj je w pożywce NBA/B27 bez doksycykliny. Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie.
    7. Na tym etapie odłączone neurony można zamrozić w specjalistycznym komercyjnym podłożu zamrażającym (patrz Tabela Materiałów) i przechowywać w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Czyste neurony mogą być platerowane z uwzględnieniem typowej ~15%-20% śmierci komórki po rozmrożeniu, hodowane samodzielnie lub współhodowane z innymi typami komórek mózgowych.
    8. Hodowlę czystych iNs na płytkach pokrytych roztworami na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów). Charakterystyczna morfologia piramidalna powinna być widoczna w 4 dniu (i 6 dniu; Rysunek 1C). Tworzenie synaps można wykryć już w dniach od 14 do 16 i jest widoczne w dniu 24 za pomocą barwienia immunohistochemicznego standardowymi markerami pre- i postsynaptycznymi. (Figura 1D; znakowana markerem presynaptycznym Synapsyna 1 i markerem dendrytycznym Map2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Ryc. 1: Bezpośrednie generowanie neuronów indukowanych przez człowieka (iN) z hPSC. (A) Schemat przepływu generacji iN. (B) Reprezentatywne obrazy jasnego pola i immunofluorescencji początkowej hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (H1) w celu potwierdzenia pluripotencji. Oct4 jest pokazany na czerwono, a Sox2 na zielono. (C) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DokładnościTechnologie STEMCELLNumer katalogowy: 7920
Suplement witaminy B27Rybak termiczny17504044
DMEM/F12 średniTechnologie STEMCELLNumer katalogowy: 36254
DmsoRybak termicznyZobacz materiał D12345
DoksycyklinaMiliporeSigmaZobacz materiał D3072
H1 ludzkie komórki ESWiCell (komórka WiCell)WA01
MatrigelCorning354234
mTeSR plusTechnologie STEMCELLNumer katalogowy: 5825
Suplement N2Rybak termiczny17502001
Neurobazalny A średniRybak termicznyNumer katalogowy 10888-022
Aminokwasy endogenneRybak termicznyNumer katalogowy: 11140-050
PeiFirma VWRNr kat. 71002-812
pMDLg/pRREAddgene powiedział:Numer katalogowy: 12251
PolibreneMiliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVAddgene powiedział:Numer katalogowy: 12253
PuromycynaRybak termicznyA1113803
STEMdiff Neuroral Progenitor Freezing MediaTechnologie STEMCELLNumer katalogowy: 5838
Zestaw do indukcji neuronowej STEMdiff SMADiTechnologie STEMCELLNumer katalogowy: 8581
Tempo-iOlogo: Ludzkie OPC pochodzące z iPSCTempo BioScienceNumer katalogowy: 102
TetO-NG2-PuroAddgene powiedział:Numer katalogowy: 52047
VSV-GAddgene powiedział:Numer katalogowy: 12259
TGL powiedział:

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsNeuron DifferentiationEngineered LentivirusesTetracycline Responsive ElementNeurogenic Transcription FactorViral TransfectionPuromycin SelectionCell Detachment SolutionECM Coated WellsMaturation Medium

Related Articles