Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Streszczenie

Źródło: Assetta, B., et al., Generacja ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Protokół

1. Indukcja ludzkich neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

1. Przygotowanie lentiwirusa (~5 dni, szczegółowy protokół jak opisano wcześniej)
   1. Płytka ~ 1 milion komórek HEK293T w każdej kolbie T75, aby zlewały się ~ 40% podczas wykonywania transfekcji. Transfekować je plazmidami eksprymującymi indukowany tetracykliną Ngn2 i gen oporny na puromycynę (PuroR; pod tą samą kontrolą promotora TetO), rtTA i trzema plazmidami pomocniczymi pRSV-REV, pMDLg / pRRE i VSV-G (12 μg DNA wektora lentiwirusowego i 6 μg każdego z DNA plazmidu pomocniczego). Przygotować co najmniej trzy kolby na preparat lentiwirusa. Użyj PEI do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Wymień nośnik po 16 godzinach i wyrzuć.
   2. Zbierz uwolnione cząsteczki wirusa, zbierając pożywki hodowlane codziennie i zastępując je świeżymi pożywkami przez 3 dni. Zebrać zebrane pożywki zawierające cząstki wirusa do oczyszczenia. Przefiltrować wirusa przez filtr 0,22 μm i odwirować przy 49 000 x g przez 90 minut. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości PBS-glukozy (~150 μL).
2. Indukcja neuronów (~5 dni)
   nuta: Ten protokół indukcji (ryc. 1A; diagram przepływu) jest wysoce skuteczny zarówno w przypadku komórek iPS, jak i ES o zwalidowanej pluripotencji (którą można oznaczyć przez barwienie immunohistochemiczne dobrze scharakteryzowanych markerów pluripotencji; Rysunek 1B).
   1. Należy użyć dostępnych w handlu ludzkich komórek ES H1 w czasie 52 (patrz tabela materiałów). Hodować komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową pokrytych roztworem (~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową; patrz Tabela Materiałów) przy użyciu pożywki do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   2. W dniu -2 odłączyć komórki ES (80% zlewające się) z 1 ml roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść komórki do probówki; umyć studzienkę 2 ml pożywki i połączyć w tej samej probówce. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce i umieścić komórki na pokrytych matrycą płytkach 6-dołkowych o gęstości wysiewu 1 x 10₅ komórek na studzienkę.
   3. W dniu -1 dodać lentiwirusy eksprymujące Ngn2 plus PuroR i rtTA wraz z polibrenem (8 μg/ml) do komórek ES w świeżej pożywce podtrzymującej komórki ES (patrz tabela materiałów). Dokładna ilość wirusów powinna być określona na podstawie rzeczywistych mian lub miareczkowania. Zazwyczaj dodajemy 5 μl każdego wirusa na studzienkę do płytki 6-dołkowej.
   4. W dniu 0 dodać Doksycyklinę (2 μg/ml w celu aktywacji ekspresji Ngn2) w pożywce DMEM-F12 z suplementem N2 bez morfogenów.
   5. W dniu 1 dodać Puromycynę do świeżej pożywki DMEM-F12 plus N2 i doksycykliny, do końcowego stężenia 1 μg/ml pożywki. Selekcjonować transdukowane komórki w Puromycynie przez co najmniej 24 godziny. Wyższe stężenie puromycyny (do 5 μg/ml) i dłuższy okres selekcji (do 48 godzin) mogą być wymagane w celu odpowiedniego usunięcia niedostatecznie transdukowanych komórek, jeśli miano wirusa jest niskie.
   6. W dniu 2 odłącz różnicujące neurony roztworem do odłączania komórek (patrz Tabela materiałów), ponownie pokryj je na 24-dołkowych płytkach (między 80 000-200 000 komórek / dołek) pokrytych roztworem matrycy (patrz Tabela materiałów) i utrzymuj je w pożywce NBA/B27 bez doksycykliny. Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie.
   7. Na tym etapie odłączone neurony można zamrozić w specjalistycznym komercyjnym podłożu zamrażającym (patrz Tabela Materiałów) i przechowywać w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Czyste neurony mogą być platerowane z uwzględnieniem typowej ~15%-20% śmierci komórki po rozmrożeniu, hodowane samodzielnie lub współhodowane z innymi typami komórek mózgowych.
   8. Hodowlę czystych iNs na płytkach pokrytych roztworami na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów). Charakterystyczna morfologia piramidalna powinna być widoczna w 4 dniu (i 6 dniu; Rysunek 1C). Tworzenie synaps można wykryć już w dniach od 14 do 16 i jest widoczne w dniu 24 za pomocą barwienia immunohistochemicznego standardowymi markerami pre- i postsynaptycznymi. (Figura 1D; znakowana markerem presynaptycznym Synapsyna 1 i markerem dendrytycznym Map2).

Wyniki

Ryc. 1: Bezpośrednie generowanie neuronów indukowanych przez człowieka (iN) z hPSC. (A) Schemat przepływu generacji iN. (B) Reprezentatywne obrazy jasnego pola i immunofluorescencji początkowej hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (H1) w celu potwierdzenia pluripotencji. Oct4 jest pokazany na czerwono, a Sox2 na zielono. (C) ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dokładności	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 7920
Suplement witaminy B27	Rybak termiczny	17504044
DMEM/F12 średni	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 36254
Dmso	Rybak termiczny	Zobacz materiał D12345
Doksycyklina	MiliporeSigma	Zobacz materiał D3072
H1 ludzkie komórki ES	WiCell (komórka WiCell)	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 5825
Suplement N2	Rybak termiczny	17502001
Neurobazalny A średni	Rybak termiczny	Numer katalogowy 10888-022
Aminokwasy endogenne	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 11140-050
Pei	Firma VWR	Nr kat. 71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12251
Polibrene	MiliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12253
Puromycyna	Rybak termiczny	A1113803
STEMdiff Neuroral Progenitor Freezing Media	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 5838
Zestaw do indukcji neuronowej STEMdiff SMADi	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 8581
Tempo-iOlogo: Ludzkie OPC pochodzące z iPSC	Tempo BioScience	Numer katalogowy: 102
TetO-NG2-Puro	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 52047
VSV-G	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12259

TGL powiedział: