Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Abstract

Źródło: Hubbard, K. et al., Funkcjonalna ocena biologicznych neurotoksyn w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych.J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Protocol

1. Różnicowanie neuronalne

UWAGA: Wykonaj kroki 1.1 - 1.5 przed południem i krok 1.7 po południu. Przegląd procedur różnicowania przedstawiono na rysunku 1A.

1. Przenieść 350 μl (3,5 x 10⁶) ESC do 10 cm naczynia o niskim stopniu nasady, zawierającego 25 ml pożywki różnicującej. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30 - 45 obr./min w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Jest to pierwszy dzień różnicowania, określany jako dzień in vitro (DIV) -8,
   nuta: Zastosowanie bardzo niskiej płytki mocującej zwiększa koszt metody, ale daje nieco większe plony niż bakteryjne szalki Petriego, ponieważ agregaty mogą czasami przylegać do szalek Petriego. Jeśli preferowane są różne rozmiary naczyń, średnie objętości i numery komórek mogą być odpowiednio skalowane.
2. Po 48 godzinach (DIV -6) za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść agregacje komórek różnicujących się do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Natychmiast dodać świeże 25 ml pożywki różnicującej do szalki Petriego.
3. Pozwól kruszywu osiąść przez 2 - 5 minut, wytwarzając widoczną granulkę o głębokości 1 - 2 mm. Zignoruj pojedyncze komórki lub małe agregaty pozostające w zawiesinie. Ostrożnie odessać pożywkę i przenieść osad komórkowy z powrotem na szalkę Petriego za pomocą P1000. Umieścić na wytrząsarce obrotowej w inkubatorze do hodowli tkankowych.
4. Przy bloku DIV -4 powtórz krok 1.2. Pellet będzie miał głębokość 2 - 4 mm. Zastąp 30 ml pożywki różnicującej uzupełnionej 6 μM kwasem all-trans-retinowym (RA) na płytkę Petriego. Wróć do wytrząsarki obrotowej w inkubatorze do hodowli tkankowych na dodatkowe 48 godzin.
5. Przy bloku DIV -2 powtórz krok 1.3. W tym momencie śrut będzie miał głębokość 4 - 8 mm.
6. W DIV -1 przygotować powierzchnie galwaniczne, jak w sekcji 2.
7. W DIV 0 rozmrozić 5 ml wstępnie zamrożonej pożywki do trypsynizacji NPC w temperaturze 37 °C przez 5 - 10 minut i umieścić w kapturze do hodowli tkankowych. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść kruszywo różnicujące do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Poczekaj, aż agregaty osiądą i ostrożnie zasysaj podłoże. Przemyć granulat dwukrotnie 10 ml PBS, pozwalając kruszywu osiąść między praniami.
8. Po drugim przemyciu PBS dodać do osadu 5 ml pożywki trypsynizacyjnej NPC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 2,5 minuty delikatnie przesunąć probówkę.
9. Dodaj 5 ml 0,1% inhibitora trypsyny sojowej (STI), aby dezaktywować trypsynę i wymieszać przez odwrócenie. Delikatnie rozcierać 10 - 15 razy pipetą serologiczną o pojemności 10 ml, aż do uzyskania względnie jednorodnej zawiesiny komórek.
10. Powoli przenieść zawiesinę komórek do sitka o średnicy 40 μm lub 70 μm umieszczonego na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny dodać 1 ml pożywki N2, aby przepłukać pozostałe komórki przez filtr i granulować zawiesinę zdysocjowanych komórek przez 6 minut w temperaturze 200 x g.
11. Zassać podłoże bez naruszania osadu. Przemyć komórki dwukrotnie 10 ml pożywki N2, granulować komórki przez 5 minut przy 200 x g i rozcierać między praniami za pomocą P1000. Przed drugim płukaniem policz komórki za pomocą hemocytometru.
12. Ponownie zawiesić komórki w pożywce N2 w ilości 1 x 10⁷ komórek na ml i umieścić ESN w gęstości komórek 150 000 - 200 000 komórek/^cm2.
13. Przenieść nowo posiane ESN do wilgotnego inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i utrzymywać jak w sekcji 3.

2. Przygotowanie powierzchni hodowlanych do posiewu prekursorów neuronowych w DIV 0

1. Potrawy poddane działaniu kultur tkankowych należy przygotować co najmniej 1 dzień przed posiewem. Dodać wystarczającą ilość polietylenoiminy (PEI; 25 μg/ml w sterylnym_H2O) lub poli-D-lizyny (PDL; 100 μg/ml w sterylnym_H2O) w celu przykrycia plastikowych naczyń poddanych kulturom tkankowym i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
2. Rano w dniu posiewu umyć naczynia dwukrotnie podwójnie destylowanym_H2Oi raz PBS. Po ostatnim umyciu dodaj wystarczającą ilość pożywki N2, aby przykryć naczynie (np. 1 ml na dołek naczynia 12-dołkowego lub 4 ml na naczynie o średnicy 6 cm).
3. Szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 18 mm należy przygotować co najmniej jeden dzień przed posiewem neuronów. Szkiełka nakrywkowe należy czyścić metodą plazmową przez 4 minuty.
4. Natychmiast przenieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe na przemyty etanolem parafilm na dnie dużego sterylnego naczynia i dodać 400 μl roztworu PEI lub PDL, przygotowanego jak w kroku 2.1. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
5. Rano umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą i dodaj 5 μg/ml lamininy do PBS przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C. Przed dysocjacją neuronów należy odessać lamininę i natychmiast przenieść szkiełko nakrywkowe do studzienki 12-dołkowego naczynia zawierającego 1 ml pożywki NPC, upewniając się, że strona poddana działaniu środka jest skierowana do góry.
6. Przechowuj naczynia i szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C, aż NPC będą gotowi do podania na talerzu.

3. Utrzymanie neuronów

1. W DIV 1 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną N2.
2. W DIV 2 i 4 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną B27.
3. W DIV 8 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną B27 zawierającą inhibitory mitotyczne w celu wyeliminowania zanieczyszczających komórek nieneuronalnych.
4. W DIV 12 zastąp pożywką hodowlaną B27.
5. Nie usuwaj DIV 12⁺ ESN z 5% CO₂, dopóki nie będą gotowe do użycia.

Results

Rysunek 1. ESN przystosowane do zawiesiny pozostają mitotycznie stabilne i wyrażają markery pluripotencji.(A) Schemat konserwacji i różnicowania ESC. Obecność lub brak kwasu retinowego (RZS) lub czynnika hamującego białaczkę (LIF) jest oznaczona symbolem + lub –. Przedstawiono porównanie dni in vitro (DIV) z klasycznymi etapami rozwoju (DS) dla pierwotnych kultur neuronów. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nokaut DMEM	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10829-018	Podłoże: Pożywka hodowlana ESC Formulacja i uwagi: 500 ml
100x MEM NEAA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050	Podłoże: przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca Formuła i uwagi: 6 ml
200 mM L-alanylo-L-Glutamina	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2115	6 ml
Kwalifikowany przez ES FBS	Zastosowana komórka macierzysta	ASM-5007	90 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	3 ml
55 mM 2-merkaptoetanol	Technologie życiowe	21985-023	1,1 ml
107 jednostek/ml LIF	Milipory	ESG1107	60 μL
Nokaut DMEM	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10829-018	Podłoże: Pożywka różnicująca ESC Formulacja i uwagi: 436,6 ml
100x MEM NEAA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050	Podłoże: przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 5 ml
200 mM L-alanylo-L-Glutamina	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2115	5 ml
Surowica z kwalifikacją ESC	Zastosowana komórka macierzysta	ASM-5007	50 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	2,5 ml
55 mM 2-merkaptoetanol	Technologie życiowe	21985-023	0,9 ml
PBS Dulbecco	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537	Media: Pożywka trypsynizująca NPC Formulacja i uwagi: 100 ml
0,5 mln EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Podłoże: zamrozić w 5 ml podwielokrotności Formulacja i uwagi: 0,266 ml
trypsyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8802	50 mg tabletki powlekania
Polietylenoimina, (PEI)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3143	Media: Roztwory do powlekania powierzchni Formulacja i uwagi: 2,5 μg/ml w H20
Poli-D-lizyna (PDL)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7280	Podłoże: zużyć w ciągu 1 tygodnia Formulacja i uwagi: 100 μg/ml w H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/ml w H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10565-018	Podłoże: pożywka hodowlana NPC Formulacja i uwagi: 492,5 ml
100x witaminy N2	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17502-048	Podłoże: przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 5 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	2,5 ml
Neuropodstawowy A	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10888-022	Podłoże: Pożywka hodowlana ESN Formulacja i uwagi: 482,5 ml
50x witaminy B27	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17504-044	Podłoże: przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca Formulacja i uwagi: 10 ml
200 mM L-alanylo-L-Glutamina	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2115	5 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-deoksyurydyna (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Media: 2000x Inhibitory mitotyczne podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C Formulacja i uwagi: dd 150 mg 5FDU i 350 mg urydyny do 10 ml Neurobasal A. Sterylny filtr, podwielokrotność i zamrożenie. Użyj 2000x w pożywce hodowlanej ESN.
Urydynę	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Ekspresowa Trypsyna	Technologie życiowe	Numer katalogowy 12605-010	Media: Różne formuły i uwagi: przechowywać w RT
Dmso	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8418	przechowuj w RT
inhibitor trypsyny sojowej (STI)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T6414	przechowywać w temperaturze -20 °C
etanol	Sigma-Aldrich	E7023	przechowuj w RT
kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	Nr kat. A4403	Przygotować 100 mM bulionu, rozpuszczając 100 mg kwasu askorbinowego w 5,7 ml mieszanki DMSO/etanol w proporcji 50:50.
kwas retinowy (RZS)	Sigma-Aldrich	Czynnik R2625	Zawiesić 15 mg RZS w 9 ml 50:50 DMSO/etanol. Uzupełnij 1 ml 100 mM bulionu kwasu askorbinowego. Podwielokrotność porcji i przechowywana w temperaturze -80 °C. Stabilna przez 6 mies.
Czyścik plazmowy	Plazma Harricka	PDC-32G
Mikroskop odwrócony Olympus IX51	Olympus	N/a
Szkiełka nakrywkowe szklane 18 mm	rybak	12-545-84
sitko komórkowe (40 μm)	rybak	08-771-1
Stovall Tancerka Brzucha Shaker	rybak	Numer katalogowy: 15-453-211
naczynia o niskiej przyczepności	rybak	05-539-101	Corning 3262
potrawy bakteryjne	Firma VWR	Nr kat. 25384-302	Wymiary: 100 x 15 mm