Magnetyczna separacja komórek Schwanna od nerwów kulszowych myszy

Streszczenie

Źródło: Blusch, A., et al., Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek Schwanna od włókien nerwu kulszowego myszy.

Protokół

1. Hodowla komórek Schwanna

1. Powłoka do hodowli komórek Schwanna
   1. Pokryj szalki z kulturami komórkowymi w sterylnych warunkach. Nałożyć 2 ml 0,01% poli-L-lizyny (PLL) na dwie szalki do hodowli tkankowych (TC) o średnicy 60 mm każda i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Usunąć PLL, umyć naczynia TC 2x wodą destylowaną i inkubować z 2 ml 1 μg/^cm2 lamininy przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć naczynia TC 2x aqua dest i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu.
2. Preparat do hodowli komórek Schwanna
   1. Przygotuj 50 ml pożywki z komórek Schwanna, dodając 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 μM forskoliny, 10 nM neureguliny i 50 μg/ml gentamycyny do zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle′s Medium (DMEM)/F-12 (wysoka glukoza) w sterylnych warunkach.
   2. Przygotować 70 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz z 50 μg/ml gentamycyny w sterylnych warunkach.
3. Trawienie enzymatyczne nerwu kulszowego
   UWAGA: Kolejne kroki wykonywane są w sterylnych warunkach.
   1. Przygotować enzymatyczny roztwór wytrawiający zawierający 0,25% dyspazy II, 0,05% kolagenazy typu I i 50 μg/ml gentamycyny w 10 ml DMEM (wysoka glukoza).
   2. Odwirować probówkę o sile 188 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i przenieść osad z pozostałą pożywką L-15 Leibovitza do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm za pomocą pipety o pojemności 1 000 ml.
   3. Przepłukać probówkę o pojemności 50 ml 10 ml roztworu do trawienia enzymatycznego i dodać go do naczynia zawierającego włókna nerwowe. Ostrożnie rozprowadź tkankę w naczyniu końcówką pipety, aby zmaksymalizować dostępną powierzchnię do trawienia.
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 18 godzin i zatrzymać trawienie, dodając 10 ml 40% FCS do zbilansowanego roztworu soli Hanksa, bez Ca²⁺ i Mg²⁺ (HBSS).
4. Separacja komórek
   1. Przenieść strawione nerwy do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej i odwirować przy 188 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM zawierającym 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny. Zawiesić osad 20 razy, używając końcówki do pipety o pojemności 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml i 200 μl.
   2. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm i odwirować przy 188 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 4 ml DMEM zawierającego 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny.
   3. Dodać 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch płytek TC o średnicy 60 mm pokrytych PLL i lamininą i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Płytki należy pozostawić nietknięte przez 2 dni w inkubatorze, aby chronić komórki przed naprężeniami mechanicznymi i wspomóc przyleganie.
5. Różnicowanie komórek Schwanna
   1. Po 2 dniach usuń pożywkę i ostrożnie spłucz płytki 2x DMEM (wysoka glukoza), 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny. Następnie dodaj 2 ml pożywki z komórek Schwanna. Wymieniaj pożywkę z komórek Schwanna co 2 dni i obserwuj wygląd i zbieżność komórek za pomocą mikroskopu.
6. Trypsynizacja komórek i separacja magnetyczna
   1. Gdy komórki osiągną zbieżność około 80% (6-12 dni hodowli), ostrożnie umyj płytki 2x 3 ml DPBS i inkubuj z 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA (wstępnie podgrzanej do 37 °C) przez 3 min. Gdy komórki oderwą się od dna płytki, dezaktywuj trawienie przez dodanie 2 ml DMEM z 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny.
      nuta: Trzymaj się czasu trypsynizacji wynoszącego ściśle 3 minuty, a następnie postępuj szybko.
   2. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do magnetycznej separacji komórek zawierającego DPBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2 nM EDTA. Połączyć 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą komory barwiącej.
   3. Odwirować zawiesinę komórek o sile 188 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl buforu do magnetycznego rozdzielania komórek na 1 x^{10 7} komórek. Dodać 10 μl mikrogranulek Thy-1 na 1 x 10⁷ komórek. Zawiesić roztwór kilka razy i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 8 °C.
   4. Dodać 2 ml buforu do magnetycznego rozdzielania komórek do zawiesiny komórek i wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do magnetycznego rozdzielania komórek.
   5. Zwilżyć magnetyczną kolumnę do separacji komórek 1 ml buforu do rozdzielania komórek magnetycznych. Umieść kolumnę separacji komórek magnetycznych w separatorze magnetycznym. Zastosuj komórki do kolumny magnetycznej separacji komórek. Zebrać przepływ i odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
      nuta: Fibroblasty są pozytywnie selekcjonowane i pozostają w kolumnie, podczas gdy komórki Schwanna przechodzą przez kolumnę. Fibroblasty mogą być zbierane za pomocą stempla (np. jako kontrola negatywna dla protokołów barwienia komórek Schwanna).
   6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki do kokultury. Policz komórki po zabarwieniu błękitem trypanowym i komorą barwiącą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej	Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy	8076.4
Sitko do komórek, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Niemcy	Numer telefonu 352360
Wirówka 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	5811000015
Inkubator CO2 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Niemcy	51017865
Dypaza II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy	4942078001
Woda destylowana (system oczyszczania wody)	Millipore, Molsheim, Francja	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy	31331093
DPBS (bez jonów wapnia i bez jonów magnezu)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy	F7524	FCS musi zostać przebadany na obecność hodowli komórek Schwanna
Gentamycyna	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy	5710064
HBSS (bez jonów wapnia i bez jonów magnezu)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy	14170138
Laminina	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy	L2020-1MG
Wielostanowiskowy MACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy	130042303
Mikronożyczki	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	Numer katalogowy: 15000-08
mikroskop	Motic, Wetzlar, Niemcy	Rower BA 400
Szkiełko mikroskopowe	VWR, Radnor, Stany Zjednoczone	630-1985
Separator MiniMACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy	130091632
Kolumny MS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy	Numer katalogowy: 130-042-201
Komora licząca Neubauera	Asystent, Erlangen, Niemcy	Numer katalogowy: 40441
Pipety	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	2231300004
Poli-L-lizyna	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy	Zobacz materiał P4707-50ML
Pipeta serologiczna, 10 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy	861254025
Pipeta serologiczna, 25 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy	861685001
Pipeta serologiczna, 5 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy	861253001
Miska TC 60, komórka +	Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy	833901300
Mikrogranulki Thy-1 (zestaw MACS)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy	Numer katalogowy: 130-094-523
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy	25300-054
Kolagenaza typu I	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy	Zobacz materiał C1639
Łaźnia wodna typ 1008	GFL, Burgwedel, Niemcy	Numer katalogowy: 4285

powiedział: