$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
- Przed dniem eksperymentalnym
- Przygotować 1 l 10-krotnego roztworu wstępnego z laboratoryjną wodą typu 1 zawierającą (w mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabela 1). Aby zapobiec wytrącaniu się fosforanu wapnia, należy powoli mieszać chemikalia w zlewce wstępnie napełnionej 800 mlH2O, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub pokojowej (RT).
- W dniu eksperymentu
- Przygotować 1 l 1x ACSF z laboratoryjną wodą typu 1 zawierającą (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucose (Tabela 2). Użyj osmometru ciśnienia pary, aby sprawdzić osmolarność w zakresie 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
nuta: Aby zapobiec wytrącaniu się fosforanu wapnia, należy powoli wymieszać wszystkie stałe substancje chemiczne w zlewce wstępnie napełnionej 800 mlH2O, ciągle mieszając mieszadłem magnetycznym. Na samym końcu dodaćMgSO4 i CaCl2, powoli ociekając w niezbędnej ilości z 1 M roztworów podstawowych.
- Ciągle bąbelkować 1x roztwór ACSF w temperaturze pokojowej z karbogenem, aby ustawić pH w zakresie 7,3–7.4,
nuta: Jeśli pH jest nieco za wysokie lub zbyt niskie, wystarczające będą niewielkie zmiany siły karbonowania. Jeśli pH jest wyższe niż 7,45 z karbonowaniem, dostosuj je, dodając kilka kropli 1 M NaH2PO4 roztworu.
- Przygotować 250 ml (na mózg) 1x roztworu plastrów o wysokiej zawartości sacharozy w zlewce zawierającej 25 ml 10-krotnego roztworu w plastrach i (w mM): 252 sacharozy, 26 NaHCO3 i 10 glukozy (Tabela 3). Sprawdź, czy osmolarność wynosi 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
- Pęcherzykować roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 10–15 minut z karbogenem, aby kontrolować pH w zakresie 7,3–7.4.
nuta: Jeśli pH jest wyższe niż 7,45 z karbonowaniem, dostosuj je, dodając kilka kropli roztworu 1 M KH2PO4 .
- Przechowuj roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy przez 20–30 minut w ultrazamrażarce (-80 °C), aż zostanie częściowo zamrożony.
2. Sekcja i umiejscowienie mysiego mózgu
- Przenieś mózg do schłodzonego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i usuń wszystkie włosy lub cząsteczki krwi z tkanki, delikatnie myjąc mózg pipetą Pasteura wypełnioną ACSF (krew ma cytotoksyczne działanie na tkankę mózgową).
- Przenieś mózg za pomocą szpatułki na nasączoną bibułę filtracyjną na schłodzonym naczyniu hodowlanym o średnicy 90 mm (ryc. 1A).
- Użyj ostrza, aby przeciąć mózg na pół, oddzielając dwie półkule, i umieść obie półkule na świeżo odciętej środkowej stronie.
- Użyj ostrza, aby usunąć grzbietową część (5%-10%) mózgu z każdej półkuli z równoległym cięciem do grzbietu (ryc. 1C) i umieść obie półkule po świeżo odciętej stronie z brzuszną częścią mózgu skierowaną do góry.
- Umieść kroplę super kleju na płytce próbki i odpowiednio rozprowadź końcówką pipety, aby pomieścić obie półkule.
- Użyj paska z bibuły filtracyjnej, aby podnieść jedną półkulę z siłami kapilarnymi, dotykając strony brzusznej paskiem z bibuły filtracyjnej, nie uszkadzając w ten sposób tkanki.
- Użyj innego paska z bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie częściowo wysuszyć grzbietową stronę mózgu przed umieszczeniem półkuli, grzbietową stroną w dół, na wierzchu kleju na płytce próbki. Powtórz tę samą procedurę z drugą półkulą.
nuta: Półkule powinny być ustawione w linii poziomej w lustrzanym odbiciu na płytce wibratomowej, z bokami rostralnymi skierowanymi na zewnątrz i bokami ogonowymi skierowanymi do siebie (ale nie stykającymi się) pośrodku. Przyśrodkowe strony obu półkul powinny być skierowane w stronę ostrza wibratomu, a boczne boki w stronę eksperymentatora (ryc. 1D).
- Umieść płytkę próbki w komorze krojenia i szybko, ale ostrożnie, przykryj ją lodowatym roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy. Gdy tylko roztwór dotknie kleju, zestali się i prawidłowo przyklei półkule do płytki próbki.
- Upewnij się, że półkule są odpowiednio pokryte roztworem plastrów o wysokiej zawartości sacharozy i potwierdź, że roztwór jest bąbelkowany karbogenem.
nuta: Cała procedura preparacji powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe. Proszę upewnić się, że mózg nie pozostaje bez dopływu tlenu przez bardzo długi czas. Od dekapitacji do zanurzenia mózgu w roztworze o wysokiej zawartości sacharozy powinno upłynąć tylko około 1–1,5 minuty. Jest to najważniejszy wymóg dla preparatów z ostrymi plastrami mózgu, aby zagwarantować wysoką jakość wycinka.
3. Poziome krojenie mózgu
- Umieść ostrze wibratomu przed przyśrodkową stroną półkul i opuść je na tę samą wysokość, co brzuszne strony półkul, które są teraz skierowane do góry. Opuść ostrze za pomocą regulatora wibratomu do 600 μm dalej w kierunku grzbietowym i rozpocznij krojenie. Ostrze powinno uderzyć w tkankę (jeśli nie, odwróć ostrze i opuść je nieco bardziej). Kroj, aż pierwsze dwa plasterki zostaną całkowicie oddzielone od dwóch półkul.
- Odwróć ostrze i opuść o kolejne 300 μm i ponownie pokrój.
- Kiedy hipokamp stanie się widoczny (w razie potrzeby użyj atlasu mózgu myszy, aby uzyskać pomoc) (Rysunek 1E) zbierz plasterki za pomocą poszerzonej plastikowej pipety Pasteura. Zbieraj plastry, aż skorupa ogoniasta stanie się widoczna obok hipokampa. Zazwyczaj do mózgu myszy można zebrać od 8 do 12 plastrów o wielkości 300 μm (4 – 6 na półkulę).
- Użyj plastikowej pipety Pasteura, aby zebrać plastry i przenieść je do komory odzyskiwania w łaźni wodnej (Rysunek 1F) (zbieraj plastry po każdej rundzie krojenia, aby zapobiec ich unoszeniu się w komorze na plastry).
nuta: Pracuj tak szybko, jak to możliwe i upewnij się, że roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy jest lodowaty i karbogenowany podczas całej procedury. W razie potrzeby uzupełnij lód otaczający komorę na plastry.
4. Odzyskiwanie wycinków mózgu do zapisów elektrofizjologicznych
- Pozostawić plastry w komorze regeneracyjnej wypełnionej ACSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C na 1 godz.
UWAGA: Komory rekuperacyjne są również dostępne na rynku.
- Wyjmij komorę regeneracyjną z łaźni wodnej.
- Umieść plastry w temperaturze pokojowej na co najmniej kolejne 30 minut w celu wyzdrowienia przed rozpoczęciem dalszej aplikacji.
Receptury i mediów.
Tabela 1: 10 x roztwór wstępny w postaci plastra (1 L).
pkt.
pkt.
pkt.
| związek | Stężenie (mM) | Masa cząsteczkowa (g/mol) | Ilość (g) |
| Kcl | 25 | Klasa 74,55 | 1,86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | Wynik 2,94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246,48 | Godzina 2,46 |
| KH2PO4 | Rozdział 12,5 | 136.08 | Pytanie 1.7 |
Tabela 2: 1x ACSF (1 L) (osmolarność między 305-315 mOsm).
Rozdział
pkt.
pkt.
pkt.
Rozdział
pkt.
pkt.
pkt.
| związek | Stężenie (mM) | Masa cząsteczkowa (g/mol) | Ilość (g) |
| Zawartość NaCl | 125 | Klasa 58,44 | 7,3 |
| Kcl | Rozdział 2.5 | Klasa 74,55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | cyfra arabska | od 1 M roztworu CaCl2 | 2 ml |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | z 1 M roztworuMgSO4 | 1 ml |
| NaH2PO4 * 2H2O | Wydanie orzeczenia 1,25 | 156.02 | 0,2 |
| NaHCO3 | 26 | 84,01 | Rozdział 2.18 |
| Glukoza * H2O | 25 | 198,17 | Godzina 4,95 |
Tabela 3: 1x roztwór plastrów o wysokiej zawartości sacharozy (250 mL) (osmolarność między 320-325 mOsm).
TGLI
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
| związek | Stężenie (mM) | Masa cząsteczkowa (g/mol) | Ilość (g) |
| 10-krotna rozdzielczość wycinka | N/a | N/a | 25 ml |
| sacharoza | Z kolei 252 | 342,3 pkt. | Godzina 21,57 |
| NaHCO3 | 26 | 84,01 | 0,55 |
| Glukoza * H2O | 10 | 198,17 | 0,49 |
