Generowanie pochylonych wycinków ciała migdałowatego z mózgu myszy

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Bosch, D., et al. Ex vivo optogenetyczne badanie obwodów strachu w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2016)

Film pokazuje generowanie pochylonych wycinków ciała migdałowatego z mózgu myszy. Mózg jest umieszczony pod kątem na etapie próbki wibratomowej, aby uzyskać wycinki zawierające ciało migdałowate i aksony z przyśrodkowej kory przedczołowej, które tworzą połączenia synaptyczne z ciałem migdałowatym. Wycinki mózgu są utrzymywane w temperaturze fizjologicznej, aby zachować tkankę do dalszych eksperymentów.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie ostrych plastrów

Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF), roztwór do cięcia, narzędzia (nożyczki, skalpel, kleszcze, szpatułka, pipeta Pasteura) i bloki agarowe.
Uwaga: Na eksperyment wymagany jest 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), który jest przygotowywany przez rozpuszczenie chemikaliów w podwójnie destylowanym_H2O, jak wcześniej opublikowano. Roztwór do cięcia przygotowuje się przez uzupełnienie 200 ml ACSF 0,87 ml 2 M roztworu podstawowego_MgSO4
Natleniaj ACSF i roztwór tnący przez cały eksperyment za pomocą 95%_O2 i 5% CO_{2 .}
Głęboko znieczulij mysz za pomocą urządzenia do znieczulania małych zwierząt przy użyciu izofluranu (3% w tlenie). Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania kończyny.
Odetnij głowę myszy dużymi nożyczkami i natychmiast schłodź głowę w lodowatym roztworze do cięcia.
Otwórz czaszkę przez pojedyncze nacięcie w linii środkowej od ogona do rostralu i delikatnie popchnij kawałki czaszki na boki za pomocą kleszczy. Szybko usuń mózg, delikatnie wyjmując go z czaszki za pomocą małej, zaokrąglonej szpatułki. Odetnij móżdżek skalpelem. Umieść mózg w lodowatym roztworze do cięcia.
W przypadku przyśrodkowej kory przedczołowej lub miejsc wstrzyknięcia mPFC: odciąć przednią część mózgu (zawierającą mPFC) za pomocą skalpela i umieścić w lodowatym roztworze do cięcia, aż do pokrojenia.
Usuń nadmiar roztworu tnącego za pomocą bibuły filtracyjnej i przyklej tylną część mózgu do etapu wibratomowego.
W przypadku nachylonych plasterków ciała migdałowatego przyklej mózg do bloku agaru (4%) przyciętego pod kątem 35° (ryc. 1D, środek). W przypadku wycinków ciała migdałowatego koronalnego, miejsc wstrzyknięcia przyśrodkowego jądra kolankowatego / tylnego śródlaminarnego jądra wzgórza (MGm / PIN) i miejsc wstrzyknięcia mPFC, przyklej mózg bezpośrednio na scenie (ryc. 1D, po lewej i prawej). Umieść dodatkowy blok agaru za mózgiem, aby zapewnić stabilność podczas krojenia.
Umieścić stolik w komorze tnącej z lodowato natlenionym roztworem tnącym, który jest utrzymywany w temperaturze 4 °C za pomocą jednostki chłodzącej. Przygotuj ostre plastry ciała migdałowatego (320 μm) za pomocą szafirowego ostrza. Umieść plastry w komorze interfejsu zasilanej natlenionym ACSF w temperaturze pokojowej (RT).
Po przygotowaniu wycinków ciała migdałowatego należy umieścić komorę interfejsu w łaźni wodnej o temperaturze 36 °C, aby odzyskać plastry na 35 - 45 minut. Następnie zwróć komorę interfejsu do RT.
Na początku etapu 1.10 należy odciąć plastry w miejscach wstrzyknięcia, jak opisano wcześniej dla plastrów ostrego ciała migdałowatego (kroki 1.8 - 1.9). Odzyskiwanie plastrów w kąpieli wodnej nie jest tutaj wymagane. fakultatywny: Aby szybko oszacować lokalizację miejsca wstrzyknięcia, należy obserwować wycinki na stereoskopie wyposażonym w świetlówkę i odpowiednie zestawy filtrów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1. Iniekcje stereotaktyczne, przygotowanie ostrych wycinków mózgu i wizualizacja włókien presynaptycznych.(A, B) Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa. A) Zdjęcie znieczulonej myszy umieszczonej w stereotaktycznej ramie z odsłoniętą czaszką i pipetą do wstrzykiwań. Wstawka: Powiększ obraz pipety iniekcyjnej wypełnionej roztworem wirusa zmieszanym z szybkim zielonym kolorem. Po...