Generowanie koronalnego wycinka mózgu odsłaniającego obszary ciała migdałowatego z mózgu myszy

Abstract

Źródło: Bosch, D., et al. Ex vivo optogenetyczne rozwarstwienie obwodów strachu w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje przygotowanie cienkich wycinków koronalnych mózgu z mysiego mózgu, odsłaniając obszary ciała migdałowatego bogate w połączenia synaptyczne z przyśrodkowej kory przedczołowej. Wycinki są następnie odzyskiwane w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym w celu utrzymania żywotności neuronów.

Protocol

1. Przygotowanie ostrych plastrów

1. Przygotuj ACSF, roztwór do cięcia, narzędzia (nożyczki, skalpel, kleszcze, szpatułka, pipeta Pasteura) i bloki agarowe.
   UWAGA: Na eksperyment wymagany jest 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF). Jak wcześniej opublikowano, ACSF jest wytwarzany przez rozpuszczenie chemikaliów w podwójnie destylowanym H2O. Roztwór do cięcia przygotowuje się przez uzupełnienie 200 ml ACSF 0,87 ml 2 M roztworu podstawowego_MgSO4
.
2. Natleniaj ACSF i roztwór tnący przez cały eksperyment za pomocą 95%_O2 i 5% CO₂ .
3. Głęboko znieczulij mysz za pomocą urządzenia do znieczulania małych zwierząt, używając izofluranu (3% tlenu). Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania kończyny.
4. Odetnij głowę myszy dużymi nożyczkami i natychmiast schłodź głowę w lodowatym roztworze do cięcia.
5. Otwórz czaszkę przez pojedyncze nacięcie w linii środkowej od ogona do rostralu i delikatnie popchnij kawałki czaszki na boki za pomocą kleszczy. Szybko usuń mózg, delikatnie wyjmując go z czaszki za pomocą małej zaokrąglonej szpatułki. Odetnij móżdżek skalpelem. Umieść mózg w lodowatym roztworze do cięcia.
6. W przypadku miejsc wstrzyknięcia mPFC użyj skalpela, aby odciąć przednią część mózgu (zawierającą mPFC) i umieść ją w lodowatym roztworze do cięcia aż do pokrojenia.
7. Usuń nadmiar roztworu tnącego za pomocą bibuły filtracyjnej i przyklej tylną część mózgu do etapu wibratomu.
8. W przypadku wycinków ciała migdałowatego koronalnego, miejsc wstrzyknięć MGm/PIN i miejsc wstrzyknięcia mPFC, przyklej mózg bezpośrednio na scenie (ryc. 1D, po lewej i prawej). Umieść dodatkowy blok agaru za mózgiem, aby zapewnić stabilność podczas krojenia.
9. Umieścić stolik w komorze tnącej z lodowato natlenionym roztworem tnącym utrzymywanym w temperaturze 4 °C za pomocą jednostki chłodzącej. Za pomocą szafirowego ostrza przygotuj koronalne plastry ciała migdałowatego. Umieść plastry w komorze interfejsu zasilanej natlenionym ACSF w temperaturze pokojowej.

Results

Rysunek 1. Zastrzyki stereotaktyczne, przygotowanie ostrych wycinków mózgu i wizualizacja włókien presynaptycznych. (A, B) Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa. A) Zdjęcie znieczulonej myszy umieszczonej w stereotaktycznej ramie z odsłoniętą czaszką i pipetą do wstrzykiwań. Wstawka: Powiększ zdjęcie pipety iniekcyjnej wypełnionej roztworem wirusa zmieszanym z szybkim kolorem zielony...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)	Kompozycja znajduje się w odnośnikach #16 i #23
Wewnętrzne rozwiązania w zakresie poprawek	Kompozycja znajduje się w odnośnikach #16 i #23
Krajalnica, Microm HM650V	Fisher Scientific, Niemcy	Numer katalogowy: 920120
Jednostka chłodząca do krajalnicy do chusteczek, CU65	Fisher Scientific, Niemcy	Numer katalogowy: 770180
Szafirowe ostrze	Noże diamentowe Delaware
Stereoskop, SZX2-RFA16	Olympus, Japonia