Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB
1. Sekcja DG (czas: 15 min)
- Przygotować pożywki do izolacji jąder 1 i 2 (NIM1 i NIM2), bufor homogenizacyjny (HB) i pożywkę do przemywania (WM) (tabela 1). Umieść wszystkie, pożywki, odczynniki i narzędzia na lodzie, aż będą potrzebne. Umieścić homogenizator Dounce (patrz Tabela Materiałów) na lodzie podczas przygotowania (minimum 1 h przed etapem homogenizacji).
nuta: NIM1 może być przygotowywany i przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy. NIM2, HB i WM powinny być świeżo przygotowane.
ostrożność: Ostrożnie manipuluj ditiotreitolem (DTT), inhibitorem proteazy i Triton X-100. Związki te działają drażniąco na skórę i oczy, są ostro toksyczne i niebezpieczne dla środowiska wodnego. Podczas używania tych chemikaliów należy nosić rękawice ochronne, odzież, ochronę oczu i twarzy, dokładnie umyć ręce po użyciu i unikać uwolnienia do środowiska.
- Poddanie eutanazji 22-miesięcznego samca myszy C57Bl/6J przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z procedurą Home Office Schedule 1.
nuta: Zobacz dyskusję na temat uzasadnienia użycia 22-miesięcznej myszy w tym badaniu. Jednak protokół ten może być wykonywany w każdym wieku przez cały okres życia.
- Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji i przenieś go na 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) (ryc. 1). Umieść szalkę Petriego na lodzie. Usuń móżdżek za pomocą skalpela i przetnij mózg na pół między obiema półkulami (wzdłuż osi strzałkowej).
- Napełnij nową 10-centymetrową szalkę Petriego lodowatym PBS i umieść ją na lodzie. Przenieś jedną połowę mózgu na nową szalkę Petriego. Za pomocą lornetki rozłóż DG na czynniki pierwsze i powtórz ten krok, aby uzyskać drugą DG z drugiej połowy mózgu.
nuta: Kroki te (kroki 1.2-1.4) zostały zaadaptowane z wcześniej opisanej procedury. Na tym etapie ważne jest, aby postępować tak szybko, jak to możliwe, aby zachować integralność komórek.
- Przenieś dwa DG do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce i dodaj 1 ml zimnego HB.
2. Dysocjacja tkanek, izolacja pojedynczych jąder i immunologiczne barwienie anty-NeuN (Czas trwania: 2 godziny)
- Homogenizować tkankę za pomocą 10 pociągnięć luźnym tłuczkiem "A", a następnie 15 pociągnięć ciasnym tłuczkiem "B".
nuta: Homogenizację odbitą należy przeprowadzać z zaprawą na lodzie delikatnymi pociągnięciami, aby zmniejszyć ciepło spowodowane tarciem i pienieniem. Wszystkie i sprzęt powinny być wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie podczas zabiegu.
- Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 ml; przepłukać homogenizator Dounce 1 ml zimnego HB i połączyć z tą samą probówką. Dodać 3 ml HB do probówki o pojemności 15 ml i inkubować przez 5 minut na lodzie. Wymieszaj 2x, delikatnie odwracając rurkę.
- Wstępnie zwilż nasadkę sitka o pojemności 70 μm 0,5 ml HB w probówce o pojemności 50 ml. Odcedzić zawiesinę jąder od kroku 2.2, delikatnie przechylając probówkę o pojemności 15 ml do sitka komórkowego. Umyj sitko do komórek 0,5 ml HB.
- Wyjąć sitko i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, używając wirówki z odchylanym wiadrem. Odrzucić supernatant.
nuta: Odcedzenie homogenatu pomoże zredukować zanieczyszczenia, co ma kluczowe znaczenie dla cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder (sekwencjonowanie pojedynczych jąder) na dalszych etapach.
- Delikatnie zawiesić osad w 4 ml HB za pomocą pipety P1000. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Wirować w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml WM.
- Wstępnie zwilż nasadkę sitka 35 μm na probówce o pojemności 15 ml z 0,5 ml WM. Odcedź zawiesinę jąder od kroku 2.5 przez sitko do komórek, delikatnie pipetując po 0,5 ml za pomocą pipety P1000.
- Umyj nakrętkę sitka 0,5 ml WM i umieść probówkę na lodzie. Przenieść filtrat do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 500 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml WM.
- Wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml WM z mysim antyneuronalnym antygenem jądrowym (NeuN), przeciwciałem sprzężonym z AlexaFluor 488 (anty-NeuN-AF488, 1:32 000) i 1 μg/ml 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI). Inkubować przez 45 minut na lodzie w ciemności.
nuta: Aby zoptymalizować barwienie immunologiczne izolowanych jąder, zaleca się miareczkowanie przeciwciała w celu określenia optymalnego rozcieńczenia do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej. Następnie przeprowadź odpowiednie kontrole, aby potwierdzić, że warunki barwienia są optymalne. Na przykład, w przypadku sprzężonego przeciwciała anty-NeuN-AF488, przeprowadzono kontrolę negatywną (tj. Brak dodatku przeciwciała, figura 2A) i kontrolę pozytywną (tj. barwienie przeciwciałem, figura 2B) w celu oceny segregacji populacji niebarwionych i barwionych. Rozpoczynając pracę z przeciwciałem sprzężonym z AF488, zaleca się przeprowadzenie kontroli izotypu sprzężonego z AF488 w celu oceny swoistości. W przypadku stosowania przeciwciała niesprzężonego konieczne może być dodatkowe kontrole, takie jak dodanie przeciwciała drugorzędowego tylko do preparatu jądrowego, w celu oceny niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego.
3. Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FANS) w celu wykluczenia populacji neuronów (Czas trwania: 45 min)
- Zawiesinę jąder wybarwionych immunologicznie przenieść do probówki o pojemności 5 ml i trzymać na lodzie do czasu rozpoczęcia procedury cytometrii przepływowej.
nuta: W przypadku pracy z większymi kawałkami tkanki niż dwa myszy DG, może być konieczne dalsze rozcieńczanie buforem WM, aby uniknąć zatkania sortownika komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), jeśli gęstość jąder w roztworze stanie się wysoka.
- Wirować próbki przez 3 s z małą prędkością przed umieszczeniem probówek w przyrządzie FACS (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: (Konfiguracja FACS) Maszyny sortujące muszą być wyrównane na początku procedury z cząstkami kalibracyjnymi zgodnie z zaleceniami producenta. Opóźnienie kropli zostało skalibrowane za pomocą kulek lub mikrosfer (patrz tabela materiałów) zgodnie z modelem FACS. Próbki sortowano w temperaturze 4 °C w trybie czystości. Aby zmniejszyć objętość zbierania, jądra posortowano przez dyszę o średnicy 70 μm pod ciśnieniem zalecanym dla cytometru przepływowego. Jądra posortowano do 1,5 ml probówek o niskim stopniu wiązania (patrz tabela materiałów) zawierających 50 μl WM. Wszystkie probówki pobrane pokryto PBS + 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze 4 °C przez noc, aby zmniejszyć ryzyko przywierania jąder do ścianek probówki.
- Aby uzyskać dane z próbki zawiesiny barwionych jąder, należy ustawić bramki na wysokości DAPI i obszarze DAPI, aby wykluczyć szczątki komórek i zagregowane jądra (Rysunek 3A). Ponadto należy oddzielić pojedyncze jądra od wszelkich pozostałych agregatów lub szczątków komórkowych barwionych DAPI, ustawiając bramki w obszarze rozproszenia po stronie logarytmu (SSC) i obszarze rozproszenia logarytmicznego do przodu (FSC) (rysunek 3B).
- Ustaw bramki dla anty-NeuN-AF488 i obszaru FSC, aby wyizolować populację NeuN-AF488-ujemną, jak pokazano na rysunku 3C.
- Po analizie, stosując opisaną powyżej strategię bramkowania, posortuj populację NeuN-AF488-ujemną w 1,5 ml probówki zbiorczej wypełnionej 50 μl WM.
nuta: Zgodnie z opisaną powyżej strategią bramkowania i procedurą preparacji w celu wyizolowania DG od mózgu dorosłej myszy, oczekuje się, że populacja NeuN-AF488-ujemna będzie reprezentować ~14% pojedynczych jąder.
Tabela 1: Kompozycje pożywek i użytych w badaniu.
zł
szt.
LAT
Rozdział
zł
osób
osób
osób
zł
pkt.
osób
zł
.
pkt.
zł
osób
| Pożywka do izolacji jąder #1 (NIM1) – przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C |
| składnik | Objętość (μL) | Stężenie końcowe (mM) |
| 1,5 mln sacharozy | 1 833,30 | Z kolei 250 |
| 1 mln KCl | Z dnia 275 | 25 |
| 1 M MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 M bufor Tris, pH 8,0 | Rozdział 110 | 10 |
| Woda wolna od nukleaz | 8 726,70 | - |
| Całkowita objętość | 11 000 | - |
| Pożywka do izolacji jąder #2 (NIM2) – odśwież |
| składnik | Objętość (μL) | Końcowe stężenie |
| Klasa NIM1 | 10 769 | - |
| 1 mM naziemna telewizja cyfrowa | 11 | 1 μM |
| 100x inhibitor proteazy | Rozdział 110 | 1x |
| Triton X-100 10% (v/v) | Rozdział 110 | 0,1% (v/v) |
| Całkowita objętość | 11 000 | - |
| Bufor homogenizacyjny (HB) – zrób świeże |
| składnik | Objętość (μL) | Końcowe stężenie |
| Klasa NIM2 | 10 958,75 | - |
| Inhibitor RNazy, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 j. ml-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | godz. 13.75 | 50 U mL-1 |
| Całkowita objętość | 11 000 | - |
| Umyj media (WM) |
| składnik | Objętość (μL) | Końcowe stężenie |
| Powierzchnia basowa 7,5% | 1 466,70 | 1 proc |
| Inhibitor RNazy, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 j. ml-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | godz. 13.75 | 50 U mL-1 |
| Pbs | 9 492,05 | - |
| Całkowita objętość | 11 000 | - |
