Technika izolowania jąder od komórek nieneuronalnych w zakręcie zębatym hipokampa

Streszczenie

Źródło: Kerloch, T., et al. Fluorescence-activated nuclei Negative Sorting of neurons Combined with Single Nuclei RNA Sequencing to Study the Hippocampal Neurogenic Niche. J. Vis. Exp. (2022).

Film demonstruje metodę izolowania nienaruszonych jąder z komórek glejowych i macierzystych w zakręcie zębatym hipokampa myszy (DG). Tkanka DG jest mechanicznie dysocjowana w zimnym buforze homogenizacyjnym w celu uwolnienia jąder. Szczątki tkanek i inne uwolnione organelle są odrzucane, a jądra są barwione barwnikiem DNA i przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem specyficznym dla neuronalnego antygenu jądrowego (NeuN). Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją jest następnie stosowane do izolowania jąder NeuN-ujemnych komórek nieneuronalnych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB

1. Sekcja DG (czas: 15 min)

1. Przygotować pożywki do izolacji jąder 1 i 2 (NIM1 i NIM2), bufor homogenizacyjny (HB) i pożywkę do przemywania (WM) (tabela 1). Umieść wszystkie, pożywki, odczynniki i narzędzia na lodzie, aż będą potrzebne. Umieścić homogenizator Dounce (patrz Tabela Materiałów) na lodzie podczas przygotowania (minimum 1 h przed etapem homogenizacji).
   nuta: NIM1 może być przygotowywany i przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6....

Wyniki

Rycina 1: Przygotowanie zawiesiny pojedynczego jądra z wypreparowanego DG dorosłych myszy do sekwencjonowania snRNA w populacjach nieneuronalnych. Diagram przepływu opisujący główne etapy protokołu, które obejmują rozbiór myszy DG, przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder, barwienie immunologiczne NeuN i sortowanie ujemnych NeuN-FANS przed przystąpieniem do sekwencjonowania snRNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroprobówka 0,5 ml	Eppendorf	30124537
10,00 μm Mikrosfery karboksylowe Flouresbrite YG	Nauki polilogiczne	Numer katalogowy 15700-10
Probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 15 ml	Corning	430052
2 pary sterylnych kleszczy Dumont #5	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11252-30
4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
System TapeStation 4150	Agilent	N/a
5 ml okrągłodenna probówka polipropylenowa o wysokiej przejrzystości z zatrzaskiem	sokół	352063
5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem i zatrzaskiem z sitkiem	sokół	352235
Probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml	Corning	430829
Sitko do komórek 70 μm	sokół	Numer katalogowy: 352350
8 szczytowych cząstek kalibracyjnych SPHERO Rainbow	BD Nauki biologiczne	RCP-30-5A
Koraliki Accudrop	BD Nauki biologiczne	N/a
Wirówka Allegra X-30R	Beckman Coulter	N/a
Przeciwciało anty-NeuN, klon A60, koniugowany Alexa Fluor 488	Milipory	MAB377X
Cytometr przepływowy BD FACSAria	BD Nauki biologiczne	N/a
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/a
Powierzchnia basowa 7,5%	Gibco (firma Gibco)	15260037
Ditiotreitol (DTT)	Thermo Scientific	Czynnik R0861
Zestaw młynka do chusteczek higienicznych: moździerz, luźny tłuczek (A) i ciasny tłuczek (B)	Kimble	D8938-1 ZESTAW
Eppendorf Probówki Białko LoBind 1,5ml	Eppendorf	30108116
Halt, 100x inhibitor proteazy	Rybak termiczny	Numer telefonu 78429
Kcl	Każdy dostawca chemikaliów		Wykonane laboratoryjnie
LUNA-FX7 Automatyczny licznik komórek	Logos Biosystems	N/a
MgCl2	Każdy dostawca chemikaliów		Wykonane laboratoryjnie
N°10 strzeżone, sterylne skalpele jednorazowe	Swann-Morton	Numer katalogowy: 6601
Woda wolna od nukleaz	Sigma Aldrich	Zobacz materiał W4502-1L
Para sterylnych nożyczek chirurgicznych dla studentów	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91401-12
Pbs	Każdy dostawca chemikaliów		Wykonane laboratoryjnie
Inhibitor RNazy 40 U μl-1	Ambion	Zobacz materiał AM2684
RNasin 40 U μl-1	Preparat Promega	N211A
Sterylna szalka Petriego	Corning	430167
sacharoza	Sigma Aldrich	59378-500G
Bufor Tris, pH 8,0	Każdy dostawca chemikaliów		Wykonane laboratoryjnie
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Trypan niebieski	Invitrogen	Zobacz materiał T10282

powiedział: powiedział: TGL