$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Materiały
- Przed rozpoczęciem protokołu przygotuj następujące roztwory:
- Przygotować bufor ładujący, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS, 2%) do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Dodaj neutralny czerwony (NR) barwnik (końcowy 1%) do PBS.
- Przygotuj następujące roztwory, korzystając z dostępnego na rynku zestawu do dysocjacji mózgu dla dorosłych (patrz tabela materiałów).
- Aby przygotować mieszaninę enzymów 1, należy odpipetować 1,9 ml buforu Z i 50 μl enzymu P do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Aby przygotować mieszaninę enzymów 2, należy odpipetować 20 μl buforu Y i 10 μl enzymu A do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Przygotuj roztwór do usuwania zanieczyszczeń.
2. Perfuzja i rozbiór myszy
- Dootrzewnowo (i.p.) wstrzyknąć myszu 500 μl 1% barwnika NR w PBS 2-3 godziny przed znieczuleniem.
nuta: Dootrzewnowe wstrzyknięcie NR w demielinizujących się modelach myszy pomaga dostrzec zmiany chorobowe (ryc. 1).
- Znieczulij mysz pentobarbitalem (50 mg / kg, i.p.) i upewnij się, że mysz jest skutecznie znieczulona, badając reakcje bólowe.
- Otwórz klatkę piersiową myszy i odsłoń serce.
- Ostrożnie odetnij mały róg prawego przedsionka i dosercowo przelej mysz 20-30 ml zimnego PBS z lewej komory.
- Odetnij głowę myszy pod narkozą.
- Otwórz czaszkę myszy i ostrożnie uwolnij mózg z czaszki.
- Przenieś mózg do foremki do krojenia mózgu myszy i pokrój mózg na plastry o średnicy 0,1 cm.
- Usuń plastry mózgu i umieść je w zimnym PBS na szalce Petriego (60/15 mm). Za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych należy dokonać mikropreparacji zmian oznaczonych barwnikiem NR wokół ciała modzelowatego pod mikroskopem stereoskopowym.
nuta: Upewnij się, że wypreparowana tkanka jest tak kompletna, jak to możliwe, aby ułatwić późniejszy transfer; Całkowity postęp sekcji powinien zostać zakończony w ciągu 2 godzin.
- Przenieść wypreparowaną tkankę do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml zawierających odpowiednią ilość buforu do ładowania na zimno.
nuta: Połącz tkankę ciała modzelowatego od 2-3 myszy w jednej probówce jako jedną próbkę.
3. Dysocjacja tkanek
- Odwirować wypreparowaną tkankę o masie 300 ×g przez 30 s (po osiągnięciu tej prędkości) w celu zebrania próbki na dnie probówki.
- Podgrzej mieszaninę enzymów 1 i 2 do temperatury 37 °C w inkubatorze.
- Dodać 1,950 μl podgrzanej mieszanki enzymów 1 do jednej próbki i wytrawiać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
- Dodać 30 μl podgrzanej mieszanki enzymatycznej 2 i delikatnie wymieszać.
- Trawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 minut i delikatnie mieszać co 5 minut.
- Dodaj 4 ml zimnego PBS do probówki po strawieniu i delikatnie wstrząśnij.
- Umieść filtry 70 μm na probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż filtry 500 μl zimnego PBS. Przefiltrować zdysocjowaną tkankę, przepuszczając strawione próbki tkanek przez filtry i przenieść przefiltrowaną zawiesinę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
nuta: Pomiń ten krok, jeśli ilość tkanki jest zbyt mała.
- Przefiltrowane próbki tkanek odwirować w temperaturze 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i powoli i całkowicie odsysać supernatant.
nuta: Wszystkie etapy powinny być wykonywane na lodzie, z wyjątkiem trawienia enzymatycznego.
4. Usuwanie gruzu
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 550 μl zimnego PBS.
- Dodaj 450 μl zimnego roztworu do usunięcia zanieczyszczeń i dobrze wymieszaj.
- Powoli i delikatnie nałożyć powyższą mieszaninę na 2 x 1 ml zimnego PBS za pomocą pipety 1 000 μl.
nuta: Przechylić probówkę wirówkową o 45 ° i powoli dodawać PBS wzdłuż ścianki probówki za pomocą pipety.
- Powoli i delikatnie przenieść probówkę do wirówki i wirować w temperaturze 4 °C i 3 000 × g przez 10 minut.
- Po odwirowaniu poszukaj trzech warstw. Całkowicie odessać dwie górne warstwy za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 2).
- Napełnij probówkę do 5 ml buforem do ładowania na zimno i delikatnie odwróć probówkę trzy razy.
- Wirować w temperaturze 4 °C i 1 000 × g przez 10 min. Całkowicie odessać supernatant i unikać rozerwania osadu komórkowego.
5. Magnetyczna separacja komórek mikrogleju
- Zawiesić osad komórkowy za pomocą 90 μl buforu ładującego i dodać 10 μl kulek CD11b (Microglea).
- Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 1 ml buforu ładującego i delikatnie pipetować płyn w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby umyć komórki po inkubacji. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 300 × g przez 10 minut i całkowicie odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych kulek.
- Ponownie zawiesić komórki w 500 μl bufora ładującego.
- Umieść kolumnę MS z separatorem w celu pozytywnej selekcji w polu magnetycznym.
- Przepłukać kolumnę 500 μl buforu ładującego w celu ochrony komórek i zapewnienia wydajności sortowania magnetycznego, zgodnie z protokołem producenta.
- Zawiesinę komórek nanieść na kolumnę MS i odrzucić przepływową zawartość nieoznakowanych komórek.
- Dodać 500 μl buforu ładującego do kolumny trzykrotnie, aby zmyć komórki, które przylegają do ścianki kolumny i wyrzucić przepływ.
nuta: Nowy bufor załadowczy do mycia należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty.
- Po umyciu kolumny należy wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Dodaj 1 ml buforu ładującego do kolumny i popchnij tłok na dno, aby wypłukać magnetycznie oznakowane komórki. Powtórz ten krok trzy razy, aby całkowicie zebrać magnetycznie oznakowane komórki.
