Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie roztworu
- Płytki agarowe NGM (1 L)
- Dodać 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej (np. Bacto-Peptonu) i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w 95% bulionie etanolu [EtOH]), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4 i 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml bulionu).
- Płytki NGM-Agar RNAi (1 L)
- Dodaj 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg / ml w 95% zapasie EtOH), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4, 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml zapasu), 1 ml 1 M izopropylu β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 1 ml karbenicyliny (50 mg / ml).
- Luria-Bertani (LB)-Agar (1 L)
- Dodać 10 g pożywki peptonowej, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 20 g agaru, 10 ml 1 M Tris pH 8,0. DodaćH2Odo 1 L. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml 50 mg/ml karbenicyliny i 2,5 ml 5 mg/ml tetracykliny.
- LB Średni (1 L)
- Dodać 10 g pożywki peptonowej, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl i 10 ml 1 M Tris pH 8,0. DodaćH2Odo 1 L. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml karbenicyliny o stężeniu 50 mg/ml.
- Bufor M9 (1 L)
- Dodać 6,0 g Na2HPO4, 3 g K2PO4, 5 g NaCl i 50 mg żelatyny. Przed użyciem dodać 1 ml 1 M MgSO4.
- Roztwór wybielający (10 ml)
- Dodać 1 ml NaClO i 2 ml 5 N NaOH. DodaćH2Odo 10 ml.
2. Przygotowanie płytek RNAi
Uwaga: C. elegans jest zazwyczaj hodowany w laboratorium na 6 cm płytkach Petriego zawierających 7,5 ml agaru Nematode Growth Medium (NGM-Agar). Protokół ten jest zoptymalizowany dla robaków trzymanych w temperaturze 15 °C. Do przygotowania płytek z NGM należy stosować standardowe techniki sterylne, aby zapobiec skażeniu grzybiczemu i bakteryjnemu. Poniżej znajduje się protokół przygotowania płytek NGM uzupełnionych odczynnikami do RNAi.
- Przygotuj 6-centymetrowe płytki RNAi NGM-Agar zawierające 1 mM IPTG i 50 μg/ml karbenicyliny. Pozostaw je do wyschnięcia na 24 – 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Płytki RNAi należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Nie stosować, jeśli jest starszy niż 14 dni.
- Wybierz klon bakterii RNAi (Escherichia coli HT115) zawierający plazmid L4440 z sekwencją DNA genu lin-53 z zamrożonego zapasu glicerolu z dostępnej biblioteki RNAi13 na płytkach LB-agar zawierających 50 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, stosując trójfazowy wzór smugowy. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez noc. Ten klon umożliwia zależną od IPTG produkcję lin-53 dsRNA w bakteriach.
- Dodatkowo hoduj bakterie RNAi, które zawierają plazmid L4440 bez żadnej sekwencji genów jako pustą kontrolę wektora.
- Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię z lin-53 lub pustych płytek wektorowych LB-agar za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl i zaszczep każdą z nich do oddzielnej probówki hodowlanej zawierającej 2 ml płynnego podłoża LB uzupełnionego 50 μg / ml karbenicyliny. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C, aż osiągną gęstość optyczną (OD) 0,6 – 0,8 przy długości fali 600 nm. Zmierz średnicę zewnętrzną za pomocą spektrofotometru.
UWAGA: Płynna pożywka LB nie powinna zawierać tetracykliny, w przeciwieństwie do płytki agarowej LB używanej do usuwania bakterii z glicerolu, ponieważ włączenie tetracykliny podczas karmienia prowadzi do zmniejszenia wydajności RNAi.
- Dodać 500 μl każdej kultury bakteryjnej (lin-53 lub pusty wektor) do 6 cm płytek RNAi NGM-Agar za pomocą multipipety. Inkubować płytki z zamkniętą pokrywką przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności do wyschnięcia. W tym czasie IPTG w płytkach NGM będzie indukować produkcję dsRNA w bakteriach.
- Użyj co najmniej 3 płytek na kulturę bakteryjną na eksperyment. Zapewni to 3 techniczne powtórzenia dla każdego eksperymentu.
- Wysuszone płytki RNAi NGM-agar z bakteriami należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do dwóch tygodni.
3. Przygotowanie szczepu BAT28 C. elegans
- Utrzymuj szczep robaka BAT288 zawierający transgeny otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] i ntIs1 [gcy-5prom::gfp] na bakteriach OP50 za pomocą standardowych płytek NGM-Agar w temperaturze 15 °C.
Uwaga: Aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem dotyczącym hodowli nicieni, zobacz. rol-6 (su1006) jest dominującym allelem i powszechnie stosowanym fenotypowym markerem iniekcji16, który powoduje typowy ruch toczenia. Jest używany w transgenie otIs305 do śledzenia hsp-16.2prom::che-1.
- Utrzymuj szczep BAT28 w temperaturze 15 °C przez cały czas, aby zapobiec ostrożnej aktywacji transgenu hsp-16.2prom::che-1. Zmniejsz narażenie na temperatury wyższe niż 15 °C, jednocześnie radząc sobie z obciążeniem w jak największym stopniu.
- Aby zsynchronizować robaki ze starzeniem się, użyj techniki wybielania.
- Zmyć 6 cm płytki agarowe NGM zawierające dorosłe osobniki i jaja BAT28 za pomocą 900 μl buforu M9. Robaki granulowane przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.
- Dodaj 0,5 – 1 ml roztworu wybielającego i potrząsaj probówką przez około 1 minutę, aż dorosłe robaki zaczną pękać. Monitoruj za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego.
- Robaki osadzane przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.
- Przemyć osad robaka 3 razy, dodając 800 μl buforu M9 i odwirowując przy 900 x g.
- Oczyszczone jaja umieszczamy na świeżych płytkach NGM wysianych bakteriami OP50. Wyhodować wybieloną populację na bakteriach OP50 w temperaturze 15 °C, aż osiągną stadium L4 (około 4 dni). Larwy L4 można rozpoznać po białej plamie mniej więcej w połowie długości wzdłuż brzusznej strony robaka18 przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego.
nuta: Aby osiągnąć fenotyp konwersji komórki rozrodczej do neuronu po wyczerpaniu lin-53, musi on zostać zubożony w pokoleniu rodzicielskim (P0). Punktacja dla fenotypu konwersji jest przeprowadzana w następnym pokoleniu (pokolenie potomne F1). Aby osiągnąć zubożony lin-53 już w P0, zwierzęta L4 są poddawane działaniu RNAi.
- Ręcznie przenieś 50 robaków etapowych L4 na replikę za pomocą platynowego drutu na płytkę NGM, która nie zawiera żadnych bakterii i pozwól robakom odsunąć się od przenoszonych bakterii OP50. Pozwól robakom poruszać się po talerzu przez około 5 minut. Użyj bakterii z płytek RNAi NGM-Agar uprzednio obsianych bakteriami lin-53 RNAi (lub kontrolą pustego wektora), aby przenieść się na odpowiednie płytki RNAi.
- Unikaj przenoszenia bakterii OP50 na właściwe płytki RNAi. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas ekspozycji szczepu na temperatury wyższe niż 15 °C.
- Inkubować robaki na płytkach RNAi NGM-Agar w temperaturze 15 °C przez około 7 dni, aż potomstwo robaków F1 osiągnie stadium L3 – L4. Można je wyraźnie oddzielić od zwierząt P0, ponieważ są większe i grubsze niż potomstwo F1.
- Sprawdź wzrokowo pod standardowym mikroskopem stereoskopowym, czy robaki potomne F1 wykazują fenotyp wystającego sromu (pvulva), jak pokazano na rysunku 1. RNAi przeciwko lin-53 ma działanie plejotropowe i powoduje fenotyp pvul, który można wykorzystać do oceny, czy RNAi przeciwko lin-53 zakończyło się sukcesem.
nuta: RNAi przeciwko lin-53 może również powodować śmiertelność zarodków F1. Efekt ten nasila się, jeśli płytki są wystawione na działanie temperatury wyższej niż 15 °C, zanim zwierzęta osiągną etap L3 – L4. Martwe zarodki można rozpoznać po zatrzymaniu rozwoju i braku wylęgu.
- Inkubuj płytki w ciemności, ponieważ IPTG jest wrażliwy na światło.
4. Indukcja przeprogramowania komórek rozrodczych
- Inkubować badane płytki RNAi zawierające lin-53 i puste potomstwo F1 potraktowane RNAi wektorem przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności w celu aktywacji CHE-1. Użyj wentylowanego inkubatora, ponieważ pozwala to na bardziej efektywny szok cieplny.
- Pozwolić zwierzętom, które poddały się szokowi cieplnemu, dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez noc w ciemności.
- Używając standardowego mikroskopu stereoskopowego sprzężonego z fluorescencyjnym źródłem światła, zbadaj zwierzęta pod filtrem z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) pod kątem sygnałów pochodzących z gcy-5prom::gfp w środkowej części ciała robaków, jak pokazano na rysunku 2. Ustaw mikroskop dla sygnałów GFP: maksimum wzbudzenia przy 488 nm z maksimum emisji przy 509 nm.
- Oceń stopień konwersji komórek rozrodczych do neuronów, montując zwierzęta z sygnałami GFP w obszarze środkowej części ciała na szkiełkach mikroskopowych zawierających podkładkę agarową.
- Policz liczbę zwierząt wykazujących konwersję komórki rozrodczej do neuronu w porównaniu z ciemnymi zwierzętami, aby ocenić penetrację fenotypu. Zazwyczaj około 30% zwierząt wykazuje dyskretne sygnały GFP w linii zarodkowej po wyczerpaniu lin-53, podczas gdy nie więcej niż 5% zwierząt wykazuje rozproszone sygnały GFP w linii zarodkowej po pustym wektorze RNAi.
