Przeprogramowanie losu komórki komórek rozrodczych nicieni na neurony

Streszczenie

Źródło: Kolundzic, E., et al. Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanego szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje przeprogramowanie losu komórek rozrodczych nicieni na neurony. Transgeniczne larwy nicienia Caenorhabditis elegans są poddawane interferencji RNA (RNAi) w celu powalenia określonego czynnika regulującego chromatynę, co sprawia, że komórki rozrodcze ich potomstwa są bardziej podatne na przeprogramowanie losu komórki. Szok cieplny jest stosowany do potomstwa, indukując komórki rozrodcze do ekspresji specyficznego dla neuronów czynnika transkrypcyjnego, który wyzwala ich transformację w neurony, który jest identyfikowany za pomocą ekspresji fluorescencyjnego reportera.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworu

1. Płytki agarowe NGM (1 L)
   1. Dodać 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej (np. Bacto-Peptonu) i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w 95% bulionie etanolu [EtOH]), 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 1 M CaCl₂, 25 ml 1 M K₂PO₄ i 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml bulionu).
2. Płytki NGM-Agar RNAi (1 L)

Wyniki

Ryc. 1: fenotyp pvul spowodowany przez RNAi przeciwko lin-53. (Góra) Obraz kontrastu interferencji różnicowej (DIC) robaków potomnych L4 / młodego dorosłego stadium F1 pochodzących od matek kontrolnych lub leczonych RNAi lin-53. Paski skali = 20 μm. (Na dole) Zwierzęta leczone RNAi lin-53 wykazują fenotyp wystającego sromu (pvul) (czarne groty strzał). Fenotyp

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chemikalia
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Baktopepton	A. Hartenstein GmbH	tel. 211 677	Podłoża pepttonowe
Ekstrakt drożdżowy	Zastosowanie	A1552,0100
Amfoterycyna B	USBiological	A2220
CaCl2	Nauki biologiczne Merck	Numer katalogowy: 208290
cholesterol	Roth	8866.2
żelatyna	Roth	4275.3
Protokół IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	Zobacz materiał T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	Firma VWR	2,51,63,364
Na2HPO4	Roth	Zobacz materiał P030.1
Zawartość NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	Zobacz materiał KK71.1
Tris	Roth	Zobacz materiał AE15.2
Karbenicylina	Roth	634412
Tetracykliny	Roth	2371.2
Inkubatory
inkubator	Nowy Brunszwik Scientific C24	M1247-0052	na szok termiczny
inkubator	Sanyo MIR-5	5534210	do utrzymywania szczepów robaków w temperaturze 15 °C lub 25 °C
Mikroskopy
Mikroskop fluorescencyjny	M205 FA	Księga Leica
Mikroskop (obrazowanie) + kamera	Axio Imager 2 (Kamera Axio Imager 2	Zeiss
Mikroskop (obrazowanie) + kamera	Sensicam	Pco
Mikroskop stereoskopowy	Zobacz materiał SMZ745	Nikon
Szczepy bakteryjne
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lizogen: promotor lavUV5 -polimeraza T7) (indukowana przez IPTG polimeraza T7) (RNAza III minus).
Escherichia coli OP50			Szczep E. coli auksotrofu uracylu
Szczepy robaków
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			pochodzi z OH9846 przez 4x więcej krzyżowania wstecznego z N2
Klony RNAi
LIN-53 (wersja linowata)	ŹródłoBioscience	Numer identyfikacyjny I-4D14	Biblioteka Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
pusty vetor: L4440	Addgene powiedział:	#1654
Różne.
Kilof do robaków			Wykonane samodzielnie przy użyciu pipety Pasteura i drutu platynowego

)