Zastrzeżenie: Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Mechaniczna homogenizacja mózgu i rdzenia kręgowego
UWAGA: Objętości opisane w tej sekcji są wystarczające do homogenizacji połowy mózgu lub rdzenia kręgowego.
- Wstępnie schłodzić szklaną zaprawę młynka do tkanek Dounce (tabela materiałów) ustawionego na lodzie.
- Dodaj 3 ml wstępnie schłodzonego 1x zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do moździerza.
- Przenieś tkankę (mózg lub rdzeń kręgowy) z dołka płytki 6-dołkowej do szklanej zaprawy, upewniając się, że jest zanurzona w 1x HBSS i znajduje się na dnie moździerza.
- Delikatnie rozgnieć tkankę 10 pociągnięciami tłuczka A, a następnie 10 pociągnięciami tłuczka B. Przenieś homogenizowaną mieszankę do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Napełnić probówkę do końcowej objętości 10 ml za pomocą wstępnie schłodzonego 1x HBSS i wirować przez 10 minut przy 320 x g w temperaturze 4 °C.
- Odessać supernatant i dodać lodowaty 1x HBSS do każdej probówki do końcowej objętości 7 ml i delikatnie zawiesić osad przez wirowanie.
2. Usuwanie gruzu
UWAGA: Usuwanie zanieczyszczeń, składających się głównie z niestrawionej tkanki i osłonek mielinowych, jest kluczowym krokiem umożliwiającym efektywne barwienie homogenatu tkankowego dla kolejnych analiz cytometrycznych przepływowych.
- Przefiltruj każdą próbkę przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie niestrawione kawałki tkanki. Ten etap jest szczególnie ważny podczas pracy z tkankami rdzenia kręgowego, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo, że próbki te zawierają niestrawione fragmenty nerwów lub opony mózgowe, które mogą wpływać na kolejne etapy.
- Upewnij się, że końcowa objętość wynosi 7 ml w każdej probówce na próbkę. Jeśli nie, napełnij lodowatym 1x HBSS do 7 ml.
- Dodać 3 ml wstępnie schłodzonego izotonicznego roztworu perkolu (IPS) do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość 10 ml roztworu zawierającego podłoże o gradiencie gęstości o 30% stężeniu końcowym. Delikatnie zmieszać próbki, aby upewnić się, że są jednorodnie wymieszane.
- Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 700 x g w temperaturze 18 °C, upewniając się, że przyspieszenie wirówki jest ustawione na 7, a hamulec na 0,
nuta: Wirowanie powinno trwać około 30 minut.
- Delikatnie wyjąć próbki z wirówki.
nuta: Powinien być widoczny białawy krążek złożony z gruzu i mieliny unoszący się na powierzchni roztworu. Na dnie probówki powinna być widoczna osadka (zawierająca interesujące komórki).
- Ostrożnie zassać cały białawy krążek gruzu, a następnie resztę supernatantu, uważając, aby nie usunąć osadu. Pozostaw około 100 μl roztworu na wierzchu osadu komórkowego, aby uniknąć ryzyka jego przypadkowego przemieszczenia.
- Dodać 1 ml roztworu blokującego (BL) cytometrii przepływowej (FACS), ponownie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl, a następnie przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml.
- Wirować przez 5 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej (RT).
- Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiednim buforze zgodnym z dalszymi analizami
