$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie materiałów
- Bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS): Przygotować 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (tabela materiałów) w PBS-/-.
- Roztwór podstawowy kolagenazy dożylnej (20 U/μL): Zawiesić proszek w PBS+/+ (tabela materiałów), podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
nuta: Kolagenaza IV wymaga, aby MgCl2 był w pełni aktywny; nie zamrażać i nie rozmrażać roztworu kolagenazy dożylnej.
- Roztwór anestezjo-przeciwbólowy: Wymieszaj 150 μl ketaminy (150 mg/kg), 25 μl ksylazyny (5 mg/kg) i 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) w 1 ml PBS-/-.
nuta: Roztwór znieczulająco-przeciwbólowy należy przygotować doraźnie i nie przechowywać go dłużej niż jeden dzień.
- Roztwór heparyny (100 j./ml): Zawiesić proszek w PBS-/-.
- Przygotować system infuzji łączący rurkę z karafką Erlenmeyera napełnioną PBS-/-. Podłączyć igłę 23 G do końca rurki infuzyjnej. Otwórz wkładkę infuzyjną i pozwól PBS działać, aż w probówce nie będzie pęcherzyków powietrza.
- Przygotuj lupę lornetkową wyposażoną w światło.
2. Obudowa myszy C57BL/6
- Do analizy CP (splotów naczyniówkowych) komórek szpikowych lub T użyj czterech myszy dla każdej i połącz cztery CP (po dwie z każdej komory bocznej, trzeciej komory i czwartej komory CP; w sumie dla ośmiu myszy). Brak łączenia CP niesie ze sobą ryzyko niewykrycia rzadkich populacji immunologicznych w CP ze względu na ich niską liczebność.
- Pozwól myszom zaaklimatyzować się przez co najmniej 7 dni przed jakimkolwiek eksperymentem. Trzymaj myszy w warunkach wolnych od patogenów w stałej temperaturze i wilgotności, w cyklu 12/12 godzin lub 14/10 godzin światło/ciemność, z wodą i standardowym granulem pokarmu ad libitum.
3. Perfuzja PBS i sekcja mózgu
- Zważyć każdą mysz i wstrzyknąć dootrzewnowo 10 μl/g roztworu mieszanki środków znieczulająco-przeciwbólowych (krok 1.3).
- Odczekaj około 30 minut, aby uzyskać skuteczne działanie przeciwbólowe (sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palce myszy).
- Ułóż znieczuloną mysz płasko na plecach na wsporniku do sekcji i przyklej jej dłonie do wspornika do sekcji.
- Szczypiąc skórę zwierzęcia kleszczami i nożyczkami, otwórz brzuch, przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
nuta: Kiedy klatka piersiowa jest otwarta, mózg staje się niedotleniony. Trzeba precyzyjnie i szybko przechodzić przez kolejne etapy perfuzji.
- Wstrzyknąć 20 μl 100 j/ml roztworu heparyny bezpośrednio do lewej komory.
- Cienkimi nożyczkami wykonaj nacięcie co najmniej 3 mm w prawym przedsionku, aby krew mogła wypłynąć z organizmu.
- Bezpośrednio po tym należy wprowadzić igłę 23 G umieszczoną na końcu rurki infuzyjnej przez końcówkę lewej komory.
- Otwórz system infuzyjny na maksimum i poczekaj na pełną perfuzję: Używając igły 23 G o natężeniu przepływu około 6 ml/min, perfuzja jest zakończona w ciągu 3 minut.
nuta: Równomierne przebarwienia narządów, takich jak wątroba, świadczą o skuteczności perfuzji.
- Zamknąć system infuzyjny i wyjąć igłę z komory serca.
- Usuń taśmę z dłoni myszy. Umieść mysz w pozycji brzusznej.
- Szczypiąc skórę zwierzęcia kleszczami i nożyczkami, usuń skórę z czubka głowy, od oczu do uszu.
- Za pomocą nożyczek przeciąć czaszkę najpierw między oczami, a następnie bocznie od każdego oka do rdzenia kręgowego tuż nad mięśniami żwaczy. W tym celu użyj kończyny nożyczek i postępuj delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia mózgu nożyczkami.
- Otwórz czaszkę kleszczami, ściskając ją od końca między oczami.
- Użyj nożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy i wydobyć mózg za pomocą kleszczy, umieszczając ich dwa punkty po bocznej stronie mózgu, aby go przechylić i umieścić na szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS+/+. CP są następnie natychmiast zbierane.
nuta: Sprawdź, czy mózg nie jest przebarwiony, aby zweryfikować skuteczność perfuzji.
4. Wycięcie splotu naczyniówkowego z mózgu
- Umieść mózg grzbietową stroną do góry na szalce Petriego i poniżej celów lup obuocznych.
- Za pomocą kleszczy, aby utrzymać mózg na miejscu, włóż dwa końce innych kleszczy w dół przez linię środkową między półkulami.
- Użyj kleszczy, aby odciągnąć korę z modzelem i hipokampem od przegrody, odsłaniając komorę boczną i część trzeciej komory.
- Zidentyfikuj boczny CP jako długą zasłonę wyściełającą boczną komorę, która rozszerza się na obu końcach. Użyj dwóch końców cienkich kleszczy, aby złapać boczne CP. Uważaj, aby zebrać trójkątną tylną część, która może być ukryta przez tylny fałd hipokampa.
- Odciągnij korę, ciało modzelowate i hipokamp przeciwległej półkuli od przegrody, aby odsłonić całą trzecią komorę i przeciwległą komorę boczną.
- Zbierz trzeci punkt kontrolny za pomocą drobnych kleszczyków, które można zidentyfikować jako krótką strukturę o ziarnistym wyglądzie powierzchni.
- Zbierz drugi boczny CP.
- Włóż dwa końce kleszczy między móżdżek a śródmózgowie. Odłącz móżdżek od mostu i rdzenia, aby odsłonić czwartą komorę.
- Zidentyfikuj czwarty CP jako długą kulistą strukturę o ziarnistym aspekcie powierzchni, która wyściela czwartą komorę od bocznego prawego końca do lewego końca między móżdżkiem a rdzeniem. Zbierz czwarte CP za pomocą cienkich kleszczy.
nuta: Powłoka kleszczy na bazie silanu może zapobiegać lepkości CP na kleszczach.
- Powtórz kroki 3.1-4.9 dla każdej z pozostałych siedmiu myszy. W międzyczasie zebrane CP można tymczasowo przechowywać w tubie umieszczonej na lodzie.
5. Przygotowanie próbek do analizy metodą cytometrii przepływowej
- Napełnij probówkę zawierającą wszystkie wycięte CP do 750 μl PBS+/+.
nuta: Osadzanie wypreparowanego CP za pomocą cienkich kleszczyków w probówce wytwarza niewielką objętość PBS+/+. Aby uniknąć ewentualnej utraty tkanki CP, lepiej jest uzupełnić istniejącą objętość do 750 μl niż usunąć i zastąpić ją świeżymi 750 μl PBS+/+.
- Dodać 15 μl roztworu podstawowego kolagenazy dożylnej o stężeniu 20 μl (patrz krok 1.2) w celu uzyskania końcowego stężenia 400 μl.
nuta: DNAza I (150 μg/ml) może zapobiegać nadmiernemu zlepianiu się komórek.
- Inkubować CP z kolagenazą IV w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu (300 obr./min) przez 45 min.
- Delikatnie pipetuj w górę i w dół około 10 razy, aby sfinalizować dysocjację CP.
- Napełnij probówkę CP do 1,5 ml buforem MACS (patrz krok 1.1 przepisu), aby zatrzymać aktywność kolagenazy dożylnie.
nuta: Aktywność kolagenazy dożylnej jest zatrzymywana w niskich temperaturach i hamowana przez albuminę surowicy.
- Odwirować komórki w temperaturze 500 x g, przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 1,5 ml buforu MACS.
- Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 220 μl buforu MACS.