Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Streszczenie

Źródło: Sarkar, S. et al., Szybka i wyrafinowana izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności. J. Vis. Exp. (2017)

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Uprawa mieszanych kultur glejowych

1. Szybko odetnij głowy 1-2-dniowym szczeniętom za pomocą 5,5-calowych nożyczek operacyjnych i natychmiast umieść głowy w probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Zauważmy, że ta dekapitacja jest sposobem eutanazji.
2. W kapturze z laminarnym przepływem powietrza wykonaj małe nacięcie w czaszce i oponach mózgowych za pomocą 4.5-calowych prostych nożyczek do mikropreparowania. Rozpocznij cięcie od końca ogonowego do końca rostralnego (nosa). Dostań się pod skórę, korzystając z otworu utworzonego przez dekapitację.
   1. Po nacięciu oderwij jedną z półkul na bok. Następnie użyj pęsety zakrzywionej lub haczykowatej, aby usunąć cały mózg.
3. Zanurz mózg(i) w nowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Użyj 2 ml trypsyny-EDTA na mózg.
4. Umyj mózg (mózgi) świeżą pożywką wzrostową (10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), zmodyfikowaną mieszanką pożywki Eagle Medium / składników odżywczych F12 firmy Dulbecco, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu i 1% aminokwasów endogennych), dodając i usuwając pożywkę. Powtórz to 4 razy.
5. Dla każdego mózgu umieść na płytce dwie kolby T-75 zawierające pożywkę wzrostową. Dlatego dodaj do probówki 2 ml pożywki wzrostowej na mózg. Zatem będzie to odpowiednik 1 ml homogenizowanego mózgu z 8-9 ml pożywki wzrostowej na kolbę T-75.
6. Homogenizuj poprzez rozcieranie mózgu (mózgów) pipetami o różnych rozmiarach apertury, w kolejności od największego do najmniejszego. Kiedy widać, że tkanka mózgowa nie zmniejsza się, przejdź do następnej pipety. Pod koniec rozcierania zawiesina powinna być przezroczysta, bez widocznych fragmentów.
   1. Użyj kolejno pipety o pojemności 25 ml, pipety o pojemności 5 ml, a następnie pipety o pojemności 10 ml.
7. Przepuść każdą jednorodną zawiesinę mózgu przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm, aby przekształcić ją w pojedynczą hodowlę komórkową.
8. Dla każdego homogenizowanego mózgu należy umieścić na płytce dwie kolby T-75 zawierające pożywkę wzrostową, jak opisano w kroku 1.5 (1 ml homogenizowanego mózgu z 8-9 ml pożywki wzrostowej na kolbę T-75).
9. Zmień pożywkę wzrostową po 6 dniach i rosnąć do izolacji 16 dnia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Technologie życiowe	11330057
Pirogronian sodu	Technologie życiowe	11360070
MEM Aminokwasy endogenne (100x)	Technologie życiowe	11140050
L-Glutamina (100x)	Technologie życiowe	25030081
Edta	Fisher Naukowy	AM9260G
Surowica bydlęca płodu	Sigma	Numer katalogowy: 13H469
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco firmy Life Technologies	25200

szt.