Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki podobne do mikrogleju

Streszczenie

Źródło: Funes, S. et al., Ludzkie komórki mikroglejowe: Różnicowanie od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i test fagocytozy żywej komórki in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów.J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje procedurę różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w komórki podobne do mikrogleju. Proces ten polega na formowaniu ciał embrionalnych, przenoszeniu ich do powlekanych studzienek i wykorzystywaniu określonych czynników wzrostu do kierowania różnicowaniem w prymitywne prekursory makrofagów, które ostatecznie różnicują się w komórki podobne do mikrogleju.

Protokół

1. Różnicowanie mikrogleju

UWAGA: Przegląd protokołu jest podsumowany na rysunku 1.

1. Hodowla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)
   nuta: Więcej szczegółów opisujących techniki hodowli iPSC można znaleźć w innym miejscu.
   1. Rozmrażanie i konserwacja
      1. Przygotować pożywkę iPSC, podzielić ją na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Podwielokrotności rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C i stosować przez okres do 1 tygodnia. Przed użyciem pozostaw podłoże w temperaturze otoczenia na co najmniej 1 godzinę.
      2. Pokryj studzienki na płytce 6-dołkowej, dodając 1 ml 10 μg/ml lamininy 521 rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco zawierającej wapń i magnez. Przechowywać płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 2 godziny lub najlepiej przez noc. Po rozcieńczeniu należy przechowywać lamininę w temperaturze 4 °C przez 3 miesiące.
      3. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy inhibitora kinazy Rho Y27632 (inhibitor ROCK), rozcieńczając go w sterylnej wodzie. Sporządzić jednorazowe porcje roztworu inhibitora ROCK i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
      4. Przygotować 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), rozcieńczając roztwór podstawowy 0,5 M EDTA w DPBS.
      5. Aby rozmrozić fiolkę z zamrożonymi iPSC, należy umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozmrożenia. Natychmiast przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki iPSC. Wirować przy 500 × g przez 1 min.
      6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, powoli dodając 1 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do ścianki probówki, aby uniknąć zakłócenia kolonii.
      7. Dodać 1,5 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do każdej z powlekanych studzienek i przenieść zawieszone kolonie kropla po kropli do studzienek zawierających pożywkę.
         nuta: Użyj 5-7 kropli z kroku 1.1.1.6 do utrzymania kultury, ale dostosuj optymalną gęstość wysiewu dla każdej linii iPSC.
      8. Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę z boku na bok i z tyłu do przodu. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Następnego dnia należy całkowicie zastąpić pożywkę, dodając świeżą pożywkę iPSC bez inhibitora ROCK.
      9. W celu konserwacji zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
         nuta: Komórki mogą być utrzymywane bez zmiany pożywki przez 2 dni, jeśli zastosowana pożywka iPSC pozwala na elastyczny harmonogram karmienia. Zaleca się ograniczenie tego do jednego razu na przejście i tylko wtedy, gdy komórki są mniej niż w 50% zlewne.
   2. Dzielenie
      1. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml DPBS (bez wapnia i magnezu).
      2. Aby usunąć komórki, dodaj 1 ml 0,5 mM EDTA i inkubuj przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej, aż krawędzie kolonii komórek oderwą się od powierzchni studzienki. Ponownie umyj komórki DPBS i dodaj 1 ml pożywki iPSC.
      3. Oddziel kolonie komórek, delikatnie zeskrobując je za pomocą podnośnika komórkowego. Zeskrob każdy obszar studni tylko raz, aby uniknąć zakłócania spokoju kolonii.
         nuta: Alternatywne metody usuwania kolonii ze studni można znaleźć gdzie indziej.
      4. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml zebrać komórki i przenieść je kropla po kropli w stosunku 1:6 (komórki do podłoża) do wstępnie powlekanych studzienek (jak wspomniano w kroku 1.1.1.2) zawierających 1,5 ml pożywki iPSC.

2. Różnicowanie iPSC do komórek podobnych do mikrogleju (iMGs)

UWAGA: Małe cząsteczki i czynniki wzrostu są rozpuszczane w sterylnie przefiltrowanej 0,1% albuminie surowicy bydlęcej w DPBS do stężenia podstawowego 1,000 razy wyższego niż stężenie końcowe. Zaleca się różnicowanie iPSC na iMG we wczesnych pasażach. Zaleca się rutynowe kariotypowanie linii iPSC.

1. Przygotować standardowy roztwór powłokowy
   1. Rozmrozić przez noc roztwór podstawowy odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie w temperaturze 4 °C.
   2. Wstępne schładzanie mikrowirówek i końcówek pipet filtrujących w temperaturze 4 °C.
   3. Porcję 250 μl skoncentrowanego odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej umieścić w każdej probówce i natychmiast umieścić na lodzie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
   4. Aby przygotować roztwór powlekający, należy rozmrozić przez noc jedną z podwielokrotności odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie w temperaturze 4 °C.
   5. Dodaj 50 ml lodowatej mieszanki Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F12 (DMEM-F12) zoptymalizowanej pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (określanych jako DMEM-F12) do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki i trzymaj ją na lodzie.
   6. Schłodzić końcówkę pipety o pojemności 1 ml, wielokrotnie pipetując lodowaty DMEM-F12 w górę i w dół, a następnie natychmiast użyć końcówki pipety, aby przenieść 250 μl odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej do stożkowej probówki zawierającej pożywkę DMEM-F12.
      nuta: Standardowy roztwór powlekający można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
2. Tworzenie ciała zarodka (EB)
   1. Przygotować pożywkę EB, którą można utrzymywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.
   2. Gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, należy rozdzielić kolonie, przemywając 1 ml DPBS i dodając 1 ml odczynnika dysocjacyjnego przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Usunąć kolonie za pomocą podnośnika komórkowego, wielokrotnie zeskrobując, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zebrać komórki i przenieść wszystko do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml DPBS.
   3. Odwirować komórki w ilości 500 × g przez 1 minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki EB. Weź 10 μl komórek i rozcieńcz je w stosunku 1:1 błękitem trypanowym. Policz komórki za pomocą hemacytometru i na podstawie liczby komórek rozcieńczyć zapas komórek do końcowego rozcieńczenia 10 000 komórek na 100 μl. W przypadku posiewu komórek dodaj 100 μl rozcieńczonych komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki o niskiej przyczepności, okrągłodennej.
      nuta: Ogólnie rzecz biorąc, 48 dołków z 96-dołkowej płytki można uzyskać z każdej 80% zlewającej się studni iPSC.
   4. Odwirować płytkę w temperaturze 125 × g przez 3 minuty i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 4 dni. W drugim dniu należy zmienić połowę pożywki za pomocą pipety wielokanałowej i delikatnie zebrać 50 μl starej pożywki, a następnie dodać z powrotem 50 μl świeżej pożywki EB.
      nuta: W 4. dniu iPSC utworzą kuliste struktury komórkowe zwane EB, zgodnie z opisem w sekcji wyników. W razie potrzeby proces różnicowania EB może zostać przedłużony do 7 dni.
3. Wytwarzanie prymitywnych prekursorów makrofagów (PMP)
   1. Przygotować pożywkę bazową PMP, sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
   2. Pokryć studzienki na płytce 6-dołkowej, dodając 1 ml lodowatego roztworu powlekającego Matrigel i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 2 godziny lub najlepiej przez noc.
   3. W 4 dniu różnicowania EB przenieś EB do studzienek pokrytych Matrigelem, zbierając EB za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml (za pomocą pipety). Pipetuj w górę i w dół raz lub dwa razy, aby usunąć EB z dołka. Trzymaj płytkę 6-dołkową pod kątem nachylonym, aby EB mogły osiąść na krawędzi studzienki.
      nuta: Dziewięć lub dziesięć EB można pokryć na każdą studzienkę powlekaną.
   4. Gdy wszystkie EB się uspokoją, delikatnie odpipetuj i usuń starą pożywkę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, trzymając EB na krawędzi studzienki. Do każdej studzienki dodać 3 ml świeżo przygotowanej pożywki PMP complete. Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę z boku na bok i z tyłu do przodu. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
   5. Nie naruszaj płytki przez 7 dni, aby EB mogły przymocować się do dna studni. Po tym czasie należy wykonać wymianę w połowie pożywki za pomocą PMP complete medium.
      nuta: W tym momencie większość EB powinna być przymocowana do płyty. Wszystkie pływające EB można usunąć.
   6. Po 5-7 dniach sprawdź EB pod mikroskopem pola świetlnego przy 4-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że są przymocowane do dna studzienek. Zmień podłoże zgodnie z opisem w 1.2.3.5. W 21 dniu należy wykonać pełną wymianę pożywki z 3 ml pożywki PMP complete.
      nuta: W tym momencie mogą być widoczne mieloidalne komórki progenitorowe unoszące się w pożywce. Komórki te należy wyrzucić podczas zmiany pożywki.
   7. W 28 dniu należy poszukać w supernatancie okrągłych komórek określanych jako PMP i zebrać pożywkę zawierającą PMP za pomocą pipety 10 ml i pipetora automatycznego. Uważaj, aby nie przeszkadzać EBs. Przenieść PMP i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i postępować zgodnie z opisem w kroku 1.2.4.
      nuta: Zwykle PMP z tej samej linii iPSC można zebrać z pięciu dołków na 6-dołkowej płytce i zebrać razem w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   8. Dodać 3 ml świeżej kompletnej pożywki PMP w celu dalszego utrzymania EB. Ponieważ PMP wyłaniają się z EB w sposób ciągły przez ponad 3 miesiące, należy je zbierać co 4-7 dni (nie pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na żółty), jak opisano w krokach 1.2.3.7 i 1.2.3.8.
      nuta: Chociaż PMP mogą być zbierane przez kilka miesięcy, z czasem mogą zmieniać swój fenotyp.
4. Zróżnicowanie w stosunku do iMG
   1. Przygotować podłoże bazowe iMG (tabela materiałów), sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
   2. Po zebraniu PMP do stożkowej probówki o pojemności 15 ml odwirować je w stężeniu 200 × g przez 4 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić PMP za pomocą 1-2 ml podłoża podstawowego iMG. Policz komórki za pomocą hemocytometru, pobierając małą porcję i rozcieńczając 1:1 błękitem trypanowym.
      UWAGA: 0,5-1,5 × 10⁶ PMP są zwykle uzyskiwane co tydzień, w zależności od linii iPSC i wieku hodowli EB.
   3. Ponownie odwirować pozostałe komórki w temperaturze 200 × g przez 4 minuty. Rozcieńczyć PMP do pożądanego stężenia w taki sposób, aby komórki zostały posiane z gęstością ~10⁵/^cm2 na płytkach poddanych działaniu kultur komórkowych przy użyciu świeżo przygotowanej kompletnej pożywki iMG. Przeprowadzaj zmianę połowy pożywki przy użyciu świeżo przygotowanej pożywki iMG complete co 3-4 dni przez 10-12 dni, aby umożliwić końcowe różnicowanie.
      nuta: W tym momencie komórki powinny nabrać morfologii podobnej do mikrogleju. Aby potwierdzić zaangażowanie PMP w los mikrogleju, przeprowadza się analizę immunofluorescencyjną w celu potwierdzenia ekspresji markerów wzbogaconych w mikroglej, takich jak receptor purynergiczny P2RY12 i białko transbłonowe 119 (TMEM119).
   4. Aby zachować zdrowie i żywotność komórek, należy przeprowadzić wszystkie eksperymenty między 10 a 12 dniem różnicowania iMG.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat protokołu różnicowania iPSC w komórki podobne do mikrogleju.W dniu 0, gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, kolonie są dysocjowane na pojedyncze komórki i hodowane w pożywce EB w celu wywołania tworzenia EB. W 4 dniu EB są zbierane i siane w pożywce PMP w celu indukcji wytwarzania PMP. Po 28 dniach PMP są zbierane i ostatecznie różnicowane w iMG za pomocą pożywki iMG. PMP mogą być ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały do hodowli komórkowych
Płytki 6-dołkowe	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 657160
100 mm x 20 mm Hodowla tkankowa poddana zabiegowi	CELLTREAT	Numer katalogowy: 229620
Podnośnik komórek, podwójny koniec, płaskie ostrze i wąskie ostrze, sterylne	CELLTREAT	229305
96-dołkowa płytka okrągłodenna o niskiej przyczepności	Corning	Zobacz materiał 7007
Primaria 24-dołkowa zmodyfikowana wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem	Corning	353847,
Primaria 6-dołkowa, przezroczysta, modyfikowana powierzchniowo, wielodołkowa płytka hodowlana z płaskim dnem	Corning	353846
Primaria 96-dołkowa, przezroczysta, z płaskim dnem	Corning	353872
Odczynniki do dysocjacji komórek
Dokładności	Corning	25058CI	Odczynniki dysocjacyjne stosowane do różnicowania dolnych neuronów ruchowych
Odczynnik TrypLE	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 12-605-010	Odczynniki dysocjacyjne stosowane do różnicowania mikrogleju
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Odczynniki powlekające do hodowli komórkowych
Matrigel GFR Matryca membranowa	Corning™	Numer telefonu 354230	Określany jako odczynnik do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej
CellAdhere Laminin-521	Technologia STEMCELL	Numer telefonu 77004	Określany jako lamina 521
Poli-D-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P7405	Rozpuścić do 0,1 mg/ml w buforze boranowym
Poli-L-ornityna	Sigma	Zobacz materiał P3655	Rozpuścić do 1 mg/ml w buforze boranowym
Składniki nośników iPSC
Zestaw mTeSR Plus	Technologia STEMCELL	Numer katalogowy: 100-0276	Aby przygotować pożywkę iPSC, należy zmieszać składniki do 1x
Składniki nośników EB
Karabin BMP-4	Fisher Naukowy	PHC9534	Stężenie końcowe 50 ng/ml
Nośniki iPSC			Koncentracja końcowa 1x
Inhibitor ROCK Y27632	Fisher Naukowy	BD 562822	Stężenie końcowe 10 μM
Scf	PeproTech	300-07	Stężenie końcowe 20 ng/ml
VEGF (Fundusz Energii Nożnej	PeproTech	100-20A	Stężenie końcowe 50 ng/ml
Składniki nośnika bazowego PMP
GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	35050061	Koncentracja końcowa 1x
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco (firma Gibco)	15140122	Stężenie końcowe 100 U/ml
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	Koncentracja końcowa 1x
Komponenty kompletnych nośników PMP
55 mM 2-merkaptoetanol	Gibco (firma Gibco)	21985023	Stężenie końcowe 55 μM
IŁ-3	PeproTech	200-03	Stężenie końcowe 25 ng/ml
M-CSF (Płyn mózgowy)	PeproTech	300-25	Stężenie końcowe 100 ng/ml
Nośnik bazowy PMP			Koncentracja końcowa 1x
Składniki nośnika bazowego iMG
Zaawansowany DMEM/F12	Gibco (firma Gibco)	12634010	Koncentracja końcowa 1x
GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	35050061	Koncentracja końcowa 1x
Suplement N2, 100x	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17502-048	Koncentracja końcowa 1x
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco (firma Gibco)	15140122	Stężenie końcowe 100 U/ml
Elementy składowe kompletnych nośników iMG
55 mM 2-merkaptoetanol	Gibco (firma Gibco)	21985023	Stężenie końcowe 55 μM
IŁ-34	PeproTech lub Biologend	200-34 lub 577904	Stężenie końcowe 100 ng/ml
Nośnik bazowy iMG			Koncentracja końcowa 1x
M-CSF (Płyn mózgowy)	PeproTech	300-25	Stężenie końcowe 5 ng/ml
TGF-β	PeproTech	100-21	Stężenie końcowe 50 ng/ml
Składniki indukcyjnych mediów bazowych
DMEM/F12 z HEPES	Gibco (firma Gibco)	11330032	Koncentracja końcowa 1x
GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	35050061	Koncentracja końcowa 1x
Suplement N2, 100x	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17502-048	Koncentracja końcowa 1x
Aminokwasy endogenne (NEAA), 100x	Gibco (firma Gibco)	11140050	Koncentracja końcowa 1x
Elementy składowe kompletnych mediów indukcyjnych
Związek E	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	Numer katalogowy: 565790	Końcowe stężenie 0,2 μM i rozpuść odczynnik podstawowy do 2 mM w etanolu 1:1 i DMSO
Doksycyklina	Sigma	Zobacz materiał D9891	Stężenie końcowe 2 μg/ml i odczynnik podstawowy rozpuścić do 2 mg/ml w DPBS
Indukcyjne media bazowe			Koncentracja końcowa 1x
Inhibitor ROCK Y27632	Fisher Naukowy	BD 562822	Stężenie końcowe 10 μM
Pozostałe odczynniki do hodowli komórkowych
Błękit trypanowy, roztwór 0,4%	AMRESCO INC	Zobacz materiał K940-100ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	22144-77-0
DPBS z wapniem i magnezem	Corning	21-030-CV
DPBS bez wapnia i magnezu	Corning	21-031-CV	Określany jako DPBS
Nokaut DMEM/F-12	Gibco (firma Gibco)	12660012	Określany jako DMEM-F12 zoptymalizowany pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
Białko myszy Laminin, naturalne	Gibco (firma Gibco)	23017015	Określany jako laminina