1. Różnicowanie mikrogleju
UWAGA: Przegląd protokołu jest podsumowany na rysunku 1.
- Hodowla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)
nuta: Więcej szczegółów opisujących techniki hodowli iPSC można znaleźć w innym miejscu.
- Rozmrażanie i konserwacja
- Przygotować pożywkę iPSC, podzielić ją na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Podwielokrotności rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C i stosować przez okres do 1 tygodnia. Przed użyciem pozostaw podłoże w temperaturze otoczenia na co najmniej 1 godzinę.
- Pokryj studzienki na płytce 6-dołkowej, dodając 1 ml 10 μg/ml lamininy 521 rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco zawierającej wapń i magnez. Przechowywać płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny lub najlepiej przez noc. Po rozcieńczeniu należy przechowywać lamininę w temperaturze 4 °C przez 3 miesiące.
- Przygotować 10 mM roztwór podstawowy inhibitora kinazy Rho Y27632 (inhibitor ROCK), rozcieńczając go w sterylnej wodzie. Sporządzić jednorazowe porcje roztworu inhibitora ROCK i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
- Przygotować 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), rozcieńczając roztwór podstawowy 0,5 M EDTA w DPBS.
- Aby rozmrozić fiolkę z zamrożonymi iPSC, należy umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozmrożenia. Natychmiast przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki iPSC. Wirować przy 500 × g przez 1 min.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, powoli dodając 1 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do ścianki probówki, aby uniknąć zakłócenia kolonii.
- Dodać 1,5 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do każdej z powlekanych studzienek i przenieść zawieszone kolonie kropla po kropli do studzienek zawierających pożywkę.
nuta: Użyj 5-7 kropli z kroku 1.1.1.6 do utrzymania kultury, ale dostosuj optymalną gęstość wysiewu dla każdej linii iPSC.
- Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę z boku na bok i z tyłu do przodu. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnego dnia należy całkowicie zastąpić pożywkę, dodając świeżą pożywkę iPSC bez inhibitora ROCK.
- W celu konserwacji zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
nuta: Komórki mogą być utrzymywane bez zmiany pożywki przez 2 dni, jeśli zastosowana pożywka iPSC pozwala na elastyczny harmonogram karmienia. Zaleca się ograniczenie tego do jednego razu na przejście i tylko wtedy, gdy komórki są mniej niż w 50% zlewne.
- Dzielenie
- Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml DPBS (bez wapnia i magnezu).
- Aby usunąć komórki, dodaj 1 ml 0,5 mM EDTA i inkubuj przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej, aż krawędzie kolonii komórek oderwą się od powierzchni studzienki. Ponownie umyj komórki DPBS i dodaj 1 ml pożywki iPSC.
- Oddziel kolonie komórek, delikatnie zeskrobując je za pomocą podnośnika komórkowego. Zeskrob każdy obszar studni tylko raz, aby uniknąć zakłócania spokoju kolonii.
nuta: Alternatywne metody usuwania kolonii ze studni można znaleźć gdzie indziej.
- Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml zebrać komórki i przenieść je kropla po kropli w stosunku 1:6 (komórki do podłoża) do wstępnie powlekanych studzienek (jak wspomniano w kroku 1.1.1.2) zawierających 1,5 ml pożywki iPSC.
2. Różnicowanie iPSC do komórek podobnych do mikrogleju (iMGs)
UWAGA: Małe cząsteczki i czynniki wzrostu są rozpuszczane w sterylnie przefiltrowanej 0,1% albuminie surowicy bydlęcej w DPBS do stężenia podstawowego 1,000 razy wyższego niż stężenie końcowe. Zaleca się różnicowanie iPSC na iMG we wczesnych pasażach. Zaleca się rutynowe kariotypowanie linii iPSC.
- Przygotować standardowy roztwór powłokowy
- Rozmrozić przez noc roztwór podstawowy odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie w temperaturze 4 °C.
- Wstępne schładzanie mikrowirówek i końcówek pipet filtrujących w temperaturze 4 °C.
- Porcję 250 μl skoncentrowanego odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej umieścić w każdej probówce i natychmiast umieścić na lodzie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
- Aby przygotować roztwór powlekający, należy rozmrozić przez noc jedną z podwielokrotności odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie w temperaturze 4 °C.
- Dodaj 50 ml lodowatej mieszanki Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F12 (DMEM-F12) zoptymalizowanej pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (określanych jako DMEM-F12) do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki i trzymaj ją na lodzie.
- Schłodzić końcówkę pipety o pojemności 1 ml, wielokrotnie pipetując lodowaty DMEM-F12 w górę i w dół, a następnie natychmiast użyć końcówki pipety, aby przenieść 250 μl odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej do stożkowej probówki zawierającej pożywkę DMEM-F12.
nuta: Standardowy roztwór powlekający można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
- Tworzenie ciała zarodka (EB)
- Przygotować pożywkę EB, którą można utrzymywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.
- Gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, należy rozdzielić kolonie, przemywając 1 ml DPBS i dodając 1 ml odczynnika dysocjacyjnego przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Usunąć kolonie za pomocą podnośnika komórkowego, wielokrotnie zeskrobując, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zebrać komórki i przenieść wszystko do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml DPBS.
- Odwirować komórki w ilości 500 × g przez 1 minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki EB. Weź 10 μl komórek i rozcieńcz je w stosunku 1:1 błękitem trypanowym. Policz komórki za pomocą hemacytometru i na podstawie liczby komórek rozcieńczyć zapas komórek do końcowego rozcieńczenia 10 000 komórek na 100 μl. W przypadku posiewu komórek dodaj 100 μl rozcieńczonych komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki o niskiej przyczepności, okrągłodennej.
nuta: Ogólnie rzecz biorąc, 48 dołków z 96-dołkowej płytki można uzyskać z każdej 80% zlewającej się studni iPSC.
- Odwirować płytkę w temperaturze 125 × g przez 3 minuty i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 dni. W drugim dniu należy zmienić połowę pożywki za pomocą pipety wielokanałowej i delikatnie zebrać 50 μl starej pożywki, a następnie dodać z powrotem 50 μl świeżej pożywki EB.
nuta: W 4. dniu iPSC utworzą kuliste struktury komórkowe zwane EB, zgodnie z opisem w sekcji wyników. W razie potrzeby proces różnicowania EB może zostać przedłużony do 7 dni.
- Wytwarzanie prymitywnych prekursorów makrofagów (PMP)
- Przygotować pożywkę bazową PMP, sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
- Pokryć studzienki na płytce 6-dołkowej, dodając 1 ml lodowatego roztworu powlekającego Matrigel i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny lub najlepiej przez noc.
- W 4 dniu różnicowania EB przenieś EB do studzienek pokrytych Matrigelem, zbierając EB za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml (za pomocą pipety). Pipetuj w górę i w dół raz lub dwa razy, aby usunąć EB z dołka. Trzymaj płytkę 6-dołkową pod kątem nachylonym, aby EB mogły osiąść na krawędzi studzienki.
nuta: Dziewięć lub dziesięć EB można pokryć na każdą studzienkę powlekaną.
- Gdy wszystkie EB się uspokoją, delikatnie odpipetuj i usuń starą pożywkę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, trzymając EB na krawędzi studzienki. Do każdej studzienki dodać 3 ml świeżo przygotowanej pożywki PMP complete. Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę z boku na bok i z tyłu do przodu. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Nie naruszaj płytki przez 7 dni, aby EB mogły przymocować się do dna studni. Po tym czasie należy wykonać wymianę w połowie pożywki za pomocą PMP complete medium.
nuta: W tym momencie większość EB powinna być przymocowana do płyty. Wszystkie pływające EB można usunąć.
- Po 5-7 dniach sprawdź EB pod mikroskopem pola świetlnego przy 4-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że są przymocowane do dna studzienek. Zmień podłoże zgodnie z opisem w 1.2.3.5. W 21 dniu należy wykonać pełną wymianę pożywki z 3 ml pożywki PMP complete.
nuta: W tym momencie mogą być widoczne mieloidalne komórki progenitorowe unoszące się w pożywce. Komórki te należy wyrzucić podczas zmiany pożywki.
- W 28 dniu należy poszukać w supernatancie okrągłych komórek określanych jako PMP i zebrać pożywkę zawierającą PMP za pomocą pipety 10 ml i pipetora automatycznego. Uważaj, aby nie przeszkadzać EBs. Przenieść PMP i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i postępować zgodnie z opisem w kroku 1.2.4.
nuta: Zwykle PMP z tej samej linii iPSC można zebrać z pięciu dołków na 6-dołkowej płytce i zebrać razem w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Dodać 3 ml świeżej kompletnej pożywki PMP w celu dalszego utrzymania EB. Ponieważ PMP wyłaniają się z EB w sposób ciągły przez ponad 3 miesiące, należy je zbierać co 4-7 dni (nie pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na żółty), jak opisano w krokach 1.2.3.7 i 1.2.3.8.
nuta: Chociaż PMP mogą być zbierane przez kilka miesięcy, z czasem mogą zmieniać swój fenotyp.
- Zróżnicowanie w stosunku do iMG
- Przygotować podłoże bazowe iMG (tabela materiałów), sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
- Po zebraniu PMP do stożkowej probówki o pojemności 15 ml odwirować je w stężeniu 200 × g przez 4 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić PMP za pomocą 1-2 ml podłoża podstawowego iMG. Policz komórki za pomocą hemocytometru, pobierając małą porcję i rozcieńczając 1:1 błękitem trypanowym.
UWAGA: 0,5-1,5 × 106 PMP są zwykle uzyskiwane co tydzień, w zależności od linii iPSC i wieku hodowli EB.
- Ponownie odwirować pozostałe komórki w temperaturze 200 × g przez 4 minuty. Rozcieńczyć PMP do pożądanego stężenia w taki sposób, aby komórki zostały posiane z gęstością ~105/cm2 na płytkach poddanych działaniu kultur komórkowych przy użyciu świeżo przygotowanej kompletnej pożywki iMG. Przeprowadzaj zmianę połowy pożywki przy użyciu świeżo przygotowanej pożywki iMG complete co 3-4 dni przez 10-12 dni, aby umożliwić końcowe różnicowanie.
nuta: W tym momencie komórki powinny nabrać morfologii podobnej do mikrogleju. Aby potwierdzić zaangażowanie PMP w los mikrogleju, przeprowadza się analizę immunofluorescencyjną w celu potwierdzenia ekspresji markerów wzbogaconych w mikroglej, takich jak receptor purynergiczny P2RY12 i białko transbłonowe 119 (TMEM119).
- Aby zachować zdrowie i żywotność komórek, należy przeprowadzić wszystkie eksperymenty między 10 a 12 dniem różnicowania iMG.
