Zastrzeżenie: Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Dysocjacja siatkówki
UWAGA: Wszystkie poniższe kroki (do momentu pobrania komórek) muszą być przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego A2 lub B2 (BSC).
- Przygotować mieszaninę dysocjacyjną papaina/DNaza I w następujący sposób.
- W przypadku sześciu siatkówek dodać 75 μl DNazy I do probówki zawierającej 750 μl papainy i dokładnie wymieszać (mieszanina dysocjacyjna).
- W celu przygotowania indywidualnej próbki wymaganej dla tego protokołu, należy podzielić całkowitą objętość 825 μl na trzy podwielokrotności: 275 μl mieszaniny w jednej probówce o pojemności 1,5 ml na mysz (dwie siatkówki). Obliczyć odpowiednio wymagane ilości DNazy I i papainy.
UWAGA: Do sześciu siatkówek może być zdysocjowanych w jednej probówce mieszaniny Papaina/DNaza I. Jednak indywidualne przygotowanie próbki skutkuje mniejszą liczbą grudek i lepszym wzrostem komórek niż w przypadku próbek łączonych.
- Przenieś dwie siatkówki do mieszaniny dysocjacji papainy/DNazy I. Użyj pipety transferowej o powiększonej średnicy końcówki, podnieś siatkówki, poczekaj, aż siatkówki osiądą na dnie końcówki, a następnie uwolnij siatkówki bez nadmiernego użycia zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) do probówki zawierającej mieszaninę papainy/DNazy I.
- Umieścić na nutatorze i inkubować przez 10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2).
- Oddziel komórki, ostrożnie pipetując w górę i w dół (około 20-30 razy) za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Po dysocjacji komórek (tj. w wyniku uzyskania jednorodnego roztworu bez kawałków) dodaj 275 μl inhibitora proteazy jajomkoidalnej z zestawu do dysocjacji papainy, aby zneutralizować papainę. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół. UWAGA: Jeśli sześć siatkówk zostało zdysocjowanych w 825 μl mieszaniny papainy/DNazy I, wymagane jest 825 μl owomkoidu.
- Odwirować mieszaninę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 1 μl na 1 ml pożywki, rozpuszczony w 200 μg/ml w PBS) do obliczonej objętości pożywki wzrostowej (1 ml na mysz) wstępnie ogrzanej w temperaturze 37 °C.
UWAGA: W zależności od projektu eksperymentalnego, na początku okresu hodowli można dodać marker proliferacji 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU), a także 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT) lub inne wymagane czynniki.
- Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Nie dotykaj granulki na dnie tuby.
- Usunąć supernatant ostrożnie i całkowicie. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 500 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
- Przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka na oznakowanej płytce 12-dołkowej (Rysunek 1C). Przepłukać probówkę kolejnymi 500 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF i dodać ją do dołka (całkowita objętość 1 ml na studzienkę).
- Powtórzyć kroki 1.8 i 1.9 dla wszystkich pozostałych próbek.
- Ostrożnie obróć płytkę studzienki trzy razy (w przód iw tył; w lewo i w prawo). Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, CO2).
UWAGA: Jeśli używane są myszy transgeniczne, wykonaj genotypowanie dla każdego zwierzęcia (Rysunek 1D). Zidentyfikuj myszy z dodatnim i ujemnym wynikiem rekombinazy Cre i odpowiednio oznacz płytkę. W tym protokole do kolejnych kroków wykorzystano tylko komórki myszy reporterowych z dodatnim wynikiem rekombinazy Cre. Komórki próbek Cre ujemnych są zamrażane i wykorzystywane do innych zastosowań.
2. Faza wzrostu
UWAGA: Faza wzrostu trwa około 4-5 dni (Rysunek 2B). W celu dodawania cieczy do studzienek zawierających komórki, pipeta musi być skierowana na ścianę studzienki, a ciecz musi być uwalniana powoli, aby uniknąć oderwania się komórek. Nie pipetować bezpośrednio na komórki.
- Jeden dzień po dysocjacji usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
- W dniu 3 usuń pożywkę i dodaj 1 ml HBSS (temperatura pokojowa), aby usunąć resztki komórek. Kołysz się delikatnie w przód iw tył od lewej do prawej. Usuń HBSS, powtórz etap mycia i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
- Monitoruj komórki każdego dnia i oceniaj ich stan wzrostu, aż komórki osiągną 90%-100% konflufluacji. Rycina 3 przedstawia przykład dobrego wzrostu MG w czasie. Sprawdź, czy nie ma możliwego zanieczyszczenia lub śmierci komórki. Wyrzuć skażone kultury.
UWAGA: Aby monitorować i rejestrować stan komórek, rób zdjęcia w różnych powiększeniach za pomocą mikroskopu świetlnego z dołączoną kamerą i obiektywami 4x, 10x lub 20x. W tym badaniu używany jest mikroskop fluorescencyjny.
3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z powłoką poli-L-ornitynową (Poly-O) i laminy
UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy wykonywane jest znakowanie immunofluorescencyjne i konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa. Do prawidłowego obrazowania wymagane są okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 12 mm). Protokół powlekania można również znaleźć w arkuszu danych pożywki neuronalnej (patrz Tabela materiałów).
- Sterylne szkiełka nakrywkowe należy ostrożnie umieścić na środku każdego dołka 24-dołkowej płytki za pomocą sterylnych kleszczyków Dumont #2AP.
UWAGA: Umieść szkiełka nakrywkowe na środku studni. Umieszczenie szkiełek nakrywkowych blisko ściany studni spowoduje problemy z napięciem powierzchniowym w kolejnych krokach.
- Rozmrozić 2,5 ml podwielokrotności polio-o w temperaturze pokojowej i umieścić 100 μl na środku każdego szkiełka nakrywkowego.
- Inkubować płytkę dołka przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Usuń Poly-O i umyj studzienkę szkiełkiem nakrywkowym trzy razy ~ 1 ml sterylnej wody.
- Pozostaw płytkę studzienki do wyschnięcia na noc w BSC. Rozmrozić 2,5 ml Lamininy w temperaturze 4 °C przez noc.
- Następnego ranka dodać 100 μl Lamininy na środek każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Usuń Laminin ostrożnie i całkowicie.
- Utrzymuj płytkę w temperaturze 4 °C, jeśli przejście nie może być wykonane natychmiast.
UWAGA: Powlekane szkiełka nakrywkowe w przygotowanych płytkach można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C.
4. Przejście komórkowe w celu usunięcia ocalałych neuronów
UWAGA: Przejście komórkowe jest wymagane do usunięcia komórek nerwowych, a nie do zwiększenia populacji komórek. Glej dzieli się tylko kilka razy i nie będzie dalej rósł po pasażu. Nie rozcieńczać zawiesin komórkowych. Komórki z jednej studzienki zlewającej się płytki 12-dołkowej można rozprowadzić na jednym dołku płytki 12-dołkowej lub dwóch dołkach płytki 24-dołkowej. W przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych powlekanych powlekana jest tylko około jedna trzecia szkiełka nakrywkowego. Dlatego sześć szkiełek nakrywkowych znajdujących się na 24-dołkowej płytce z zlewającymi się komórkami (~ 80%-90%) można uzyskać z jednego dołka zlewających się komórek 12-dołkowej płytki. Można również wybrać inne proporcje, aby zwiększyć lub zmniejszyć gęstość komórek. Do tego protokołu używa się jednej myszy reporterowej Cre+ [jeden eksperyment, dwa zabiegi: miR-25 lub kontrola-miR; kontrpróby techniczne n = 3 (trzy szkiełka nakrywkowe na zabieg), replika biologiczna n = 1]. Liczba kontrprób technicznych i biologicznych może być różnie zdefiniowana w zależności od projektu doświadczalnego.
- Sprawdź, czy komórki są zlewające się w 90%-100% (również na brzegu studzienki; Rysunek 3E,F).
- Usuń pożywkę i dodaj 1 ml HBSS (temperatura pokojowa) do umycia. Delikatnie kołysz talerzem (w przód iw tył, w lewo i w prawo). Całkowicie usuń HBSS.
- Dodać 500 μl wstępnie podgrzanego roztworu zawierającego trypsynę (wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C w kąpieli z metalowymi kulkami) w celu odłączenia komórek od studzienki. Kołysz delikatnie (w przód i w tył, od lewej do prawej) i inkubuj przez 2 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Przenieść płytkę z inkubatora do BSC. Przechylając się, zassaj roztwór zawierający trypsynę i rozprowadź go ostrożnie i powoli kilka razy w studzience, aż komórki całkowicie się oderwą. Trzymaj płytkę pod światło i upewnij się, że na dole nie pozostały żadne komórki.
- Przenieść tę zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 600 μl (100 μl na studzienkę na 6 dołków/szkiełka nakrywkowe) wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (uzupełnionej EGF; 1:1000). i pipetowanie w górę iw dół ~30-40 razy.
UWAGA: Komórki mogą być w tym czasie zamrożone w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie i rozmrożone zgodnie ze standardowymi protokołami rozmrażania linii komórkowych. Jeśli komórki zostaną zamrożone, nie zostaną ponownie zawieszone w pożywce z dodatkiem EGF (pożywce wzrostowej). Zostaną one ponownie zawieszone w pożywce zasadowej (bez EGF) i roztworze zamrażającym (stosunek 1/1).
- Komórki nasienne, umieszczając 100 μl zawiesiny komórek/pożywki o objętości 600 μl w środku sześciu powlekanych szkiełek nakrywkowych (patrz krok 5) płytki 24-dołkowej. Ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze i pozwól komórkom osiąść.
UWAGA: 100 μL zawiesiny komórek o objętości 600 μl (pobranej z jednego dołka na 12-dołkowej płytce) spowoduje 90%-100% konfluencji komórek, która jest wymagana do transfekcji.
- Po 3 godzinach sprawdź komórki, aby zobaczyć, czy osiadły na szkiełku nakrywkowym. Dodać 400 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej EGF.
UWAGA: Komórki są zwykle gotowe do transfekcji następnego dnia (Rysunek 3G). Jeśli nie zlewają się (90%-100%), pozostaw je na kolejny dzień. Jeśli nadal nie zlewają się, nie używaj ich do transfekcji. Jeśli prowadzone są inne dalsze zastosowania, takie jak profilowanie miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR lub western blot, komórki muszą zostać przeniesione na 12-dołkowe płytki (stosunek 1:1; nie jest wymagana obróbka płytki) i zebrane w celu ekstrakcji RNA/białka.
