Izolowanie populacji komórek z tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Streszczenie

Źródło: Mussa, Z., et al. Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje procedurę izolowania i sortowania jąder ze świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS), które umożliwia badanie różnych populacji komórek dla różnych zastosowań neurologicznych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie bufora

UWAGA: Jeśli wykonujesz sekwencjonowanie RNA na dalszych etapach, dokładnie potraktuj wszystkie miejsca pracy i narzędzia roztworem do dekontaminacji RNazy, aby zapobiec degradacji mRNA.

1. Przygotować bufor do lizy.
   1. W wodzie destylowanej (_H2O) do objętości 50 ml rozpuścić następujące substancje: 5,47 g sacharozy (0,32 M wersja ostateczna), 250 μl 1 M chlorku wapnia (CaCl₂) (5 mM wersja ostateczna), 150 μl 1 M octanu magnezu (Mg(CH₃COO)₂) (3 mM wersja ostateczna), 10 μL 500 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,1 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M kwasu solnego tris-solnego (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 50 μl Triton X-100 (0,1% wersja ostateczna) i 17 μl 3 M ditiotreitolu (DTT, 1 mM wersja ostateczna, dodać świeże) (patrz tabela materiałów).
2. Przygotować bufor sacharozy
   1. W destylowanym_H2Odo 50 ml rozpuścić: 30,78 g sacharozy (1,8 M wersja ostateczna), 150 μl 1 M Mg(CH₃COO)₂ (3 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 17 μl 3 M DTT (1 mM wersja ostateczna, dodać świeżą).

2. Dysocjacja zamrożonej tkanki do zawiesiny pojedynczego jądra

1. Dodaj 4 ml lodowatego buforu do lizy do 7 ml szklanego młynka do tkanek i trzymaj na lodzie. Wypreparuj około 200-400 mg świeżo mrożonej dorosłej kory człowieka, odbij około 50 razy i przenieś homogenat tkankowy do 12 ml ultrawirówki polipropylenowej.
2. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml dodaj 6,5 ml lodowatego buforu sacharozy na dno probówki ultrawirówki, uważając, aby nie naruszyć warstwy między sacharozą a homogenatem tkankowym.
   UWAGA: W przypadku przetwarzania dodatkowych próbek należy ostrożnie zrównoważyć probówki wagowo, dodając dodatkowy bufor do lizy do lżejszej próbki. Precyzyjne wyważenie probówek ultrawirówek jest niezbędne, aby zapobiec uszkodzeniu wirnika i zapewnić obrót z odpowiednią prędkością.

3. Ultrawirowanie

1. Ultraodwirować lizat przy 24 400 obr./min (101 814 × g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i zanieczyszczenia, nie naruszając osadu.
   nuta: Osad może nie być widoczny, jeśli zaczyna się od mniej niż 200 mg tkanki.
2. Dodać 600 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (bez wapnia (^Ca2+), magnezu (Mg²⁺)) do osadu jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut przed ponownym zawieszeniem.
3. Pipetować w górę i w dół 50 razy, aby ponownie zawiesić osad jądra na lodzie.
4. Użyj hemocytometru, aby uwidocznić nienaruszone jądra pod mikroskopem i upewnić się, że stężenie resuspension przekracza 10⁵ jąder / ml przed przejściem do następnego kroku (połącz 10 μl zawieszonych jąder z 10 μl błękitu trypanowego).

4. Inkubacja przeciwciał

1. W celu immunoznakowania próbki do sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS), dodać 500 μL ponownie zawieszonego osadu próbki, 490 μL 1x PBS (wolny od Ca²⁺, Mg²⁺), 10 μL 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (0,1% końcowej), 1 μL mysiego przeciwciała anty-NeuN sprzężonego z AF (Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, stężenie końcowe 1:1000), i 1 μl mysiego przeciwciała anty-PAX6 sprzężonego z allofikocyjaniną (PAX6-APC, stężenie końcowe 1:1000).
   nuta: Można dodać alternatywne przeciwciała sprzężone z innymi fluoroforami. W tym przypadku zastosowano mysi anty-OLIG2 skoniugowany z AF488 (stężenie 1:1000) z korzystnymi wynikami.
2. Wykonaj kontrole 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) i jednokolorowe, aby ustawić parametry bramkowania, używając w razie potrzeby niewielkiej ilości próbki.
   1. Aby przeprowadzić jednokolorową kontrolę AF555, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1x PBS (bez Ca²⁺, Mg²⁺), 10 μl 10% BSA (0,1% final) i 1 μl przeciwciała NeuN-AF555 (stężenie 1:1000).
   2. Aby przeprowadzić jednokolorową kontrolę APC, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (bez Ca²⁺, Mg²⁺), 10 μL 10% BSA (0,1% final) i 1 μl przeciwciała PAX6-APC (stężenie 1:1000).
   3. Aby przeprowadzić kontrolę DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)), dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ free) i 10 μL 10% BSA (0,1% końcowy) (DAPI zostanie dodany później, patrz 4.4).
      nuta: Jeśli stosuje się więcej niż dwa przeciwciała, oprócz kontroli jednokolorowych zaleca się wykonanie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).
3. Inkubować próbki i kontrole z rotacją w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
4. Dodaj DAPI w stosunku 1:1000 do wszystkich próbek i kontroli, a następnie kontynuuj sortowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x PBS pH 7,2	Invitrogen	70013073
KLON PRZECIWCIAŁA ANTY-NEUN A60	Milipory	MAB377A5MI	mysie anty-NeuN sprzężone ze związkiem fluorescencyjnym AF555 (wzbudzenie, 553 nm; emisja, 568 nm)
PRZECIWCIAŁO ANTY-OLIG2 KLON 211	Milipory	MABN50A4MI	mysi anty-OLIG2 sprzężony ze związkiem fluorescencyjnym AF488 (wzbudzenie, 499 nm; emisja, 520 nm)
Albumina surowicy bydlęcej	rybak	Zobacz materiał BP9704-100
Komora liczenia Bright-Line	Hausser Scientific	3110V
Chlorek wapnia bezwodny	rybak	Zobacz materiał C614-3
Sitka do komórek, 40 μM	SP Scienceware	136800040
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)	Invitrogen	Zobacz materiał D1306
Młynek do tkanek odbitych	Wheaton	357542
Sortownik FACS	BD Nauki biologiczne		BD FACSAria III
Tetrahydrat octanu magnezu	rybak	Zobacz materiał M13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTÓW	Novus	NBP234705J
Sacharoza z certyfikatem kryształowym, ACS, 500 mg	rybak	Zobacz materiał S5500
SW 41 Ti Wirnik wahliwo-kubełkowy	Beckman Coulter	331362
Tris-HCl, roztwór 1M, pH 8,0, klasa biologii molekularnej, ultraczysty	Thermo Scientific	J22638AE
Silnik TritonX-100	rybak	Zobacz materiał BP151-500	Niejonowy środek powierzchniowo czynny w buforze do lizy
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	Gibco (firma Gibco)	15250061
Ultrawirówka	Redlica Beckman Optima XE-100	A94516
Probówki do ultrawirówek PP 9/16 X 3-1/2	Beckman Coulter	331372
Ultraczysta woda destylowana (wolna od RNAzy, DNAzy)	Invitrogen	10977023	Określana jako woda destylowana
Ultraczysty EDTA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15576-028

powiedział: