$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie bufora
UWAGA: Jeśli wykonujesz sekwencjonowanie RNA na dalszych etapach, dokładnie potraktuj wszystkie miejsca pracy i narzędzia roztworem do dekontaminacji RNazy, aby zapobiec degradacji mRNA.
- Przygotować bufor do lizy.
- W wodzie destylowanej (H2O) do objętości 50 ml rozpuścić następujące substancje: 5,47 g sacharozy (0,32 M wersja ostateczna), 250 μl 1 M chlorku wapnia (CaCl2) (5 mM wersja ostateczna), 150 μl 1 M octanu magnezu (Mg(CH3COO)2) (3 mM wersja ostateczna), 10 μL 500 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,1 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M kwasu solnego tris-solnego (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 50 μl Triton X-100 (0,1% wersja ostateczna) i 17 μl 3 M ditiotreitolu (DTT, 1 mM wersja ostateczna, dodać świeże) (patrz tabela materiałów).
- Przygotować bufor sacharozy
- W destylowanymH2Odo 50 ml rozpuścić: 30,78 g sacharozy (1,8 M wersja ostateczna), 150 μl 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM wersja ostateczna), 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM wersja ostateczna), 17 μl 3 M DTT (1 mM wersja ostateczna, dodać świeżą).
2. Dysocjacja zamrożonej tkanki do zawiesiny pojedynczego jądra
- Dodaj 4 ml lodowatego buforu do lizy do 7 ml szklanego młynka do tkanek i trzymaj na lodzie. Wypreparuj około 200-400 mg świeżo mrożonej dorosłej kory człowieka, odbij około 50 razy i przenieś homogenat tkankowy do 12 ml ultrawirówki polipropylenowej.
- Za pomocą pipety o pojemności 5 ml dodaj 6,5 ml lodowatego buforu sacharozy na dno probówki ultrawirówki, uważając, aby nie naruszyć warstwy między sacharozą a homogenatem tkankowym.
UWAGA: W przypadku przetwarzania dodatkowych próbek należy ostrożnie zrównoważyć probówki wagowo, dodając dodatkowy bufor do lizy do lżejszej próbki. Precyzyjne wyważenie probówek ultrawirówek jest niezbędne, aby zapobiec uszkodzeniu wirnika i zapewnić obrót z odpowiednią prędkością.
3. Ultrawirowanie
- Ultraodwirować lizat przy 24 400 obr./min (101 814 × g) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant i zanieczyszczenia, nie naruszając osadu.
nuta: Osad może nie być widoczny, jeśli zaczyna się od mniej niż 200 mg tkanki.
- Dodać 600 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (bez wapnia (Ca2+), magnezu (Mg2+)) do osadu jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut przed ponownym zawieszeniem.
- Pipetować w górę i w dół 50 razy, aby ponownie zawiesić osad jądra na lodzie.
- Użyj hemocytometru, aby uwidocznić nienaruszone jądra pod mikroskopem i upewnić się, że stężenie resuspension przekracza 105 jąder / ml przed przejściem do następnego kroku (połącz 10 μl zawieszonych jąder z 10 μl błękitu trypanowego).
4. Inkubacja przeciwciał
- W celu immunoznakowania próbki do sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS), dodać 500 μL ponownie zawieszonego osadu próbki, 490 μL 1x PBS (wolny od Ca2+, Mg2+), 10 μL 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (0,1% końcowej), 1 μL mysiego przeciwciała anty-NeuN sprzężonego z AF (Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, stężenie końcowe 1:1000), i 1 μl mysiego przeciwciała anty-PAX6 sprzężonego z allofikocyjaniną (PAX6-APC, stężenie końcowe 1:1000).
nuta: Można dodać alternatywne przeciwciała sprzężone z innymi fluoroforami. W tym przypadku zastosowano mysi anty-OLIG2 skoniugowany z AF488 (stężenie 1:1000) z korzystnymi wynikami.
- Wykonaj kontrole 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) i jednokolorowe, aby ustawić parametry bramkowania, używając w razie potrzeby niewielkiej ilości próbki.
- Aby przeprowadzić jednokolorową kontrolę AF555, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1x PBS (bez Ca2+, Mg2+), 10 μl 10% BSA (0,1% final) i 1 μl przeciwciała NeuN-AF555 (stężenie 1:1000).
- Aby przeprowadzić jednokolorową kontrolę APC, dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (bez Ca2+, Mg2+), 10 μL 10% BSA (0,1% final) i 1 μl przeciwciała PAX6-APC (stężenie 1:1000).
- Aby przeprowadzić kontrolę DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)), dodaj 20 μl zawieszonego osadu próbki, 970 μl 1X PBS (Ca2+, Mg2+ free) i 10 μL 10% BSA (0,1% końcowy) (DAPI zostanie dodany później, patrz 4.4).
nuta: Jeśli stosuje się więcej niż dwa przeciwciała, oprócz kontroli jednokolorowych zaleca się wykonanie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).
- Inkubować próbki i kontrole z rotacją w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Dodaj DAPI w stosunku 1:1000 do wszystkich próbek i kontroli, a następnie kontynuuj sortowanie.