Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Pobieranie tkanek
- Przygotować bufor X z zestawu do dysocjacji neuronalnej, dodając beta-merkaptoetanol do buforu X do końcowego stężenia 0,067 mM (dla 4 próbek dodać 13,5 μl 50 mM beta-merkaptoetanolu do 10 ml buforu X).
- Przygotuj mieszankę enzymów 1, mieszając 50 μl enzymu P z 1 900 μl buforu X dla każdej próbki, jak opisano w protokole zestawu do dysocjacji neuronów Na przykład dla 4 próbek zmieszaj 200 μl enzymu P z 7 600 μl buforu X.
- Umieścić bufor X w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Umieścić 2 ml zimnego buforowanego roztworu soli Hanka (HBSS) (bez Ca++ i Mg++) w jednym dołku sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej dla każdej próbki, która zostanie pobrana i przechowywana na lodzie w celu wypreparowania tkanki.
2. Dysocjacja neuronalna (1 godz.)
- Pokrój każdą próbkę tkanki w kostkę na małe kawałki za pomocą sterylnych żyletek na pokrywie 6-dołkowej płytki hodowlanej. Protokół ten był stosowany do próbek tkanek o wielkości około 30 - 100 mg, ale został zatwierdzony dla próbek tkanek o wielkości do 400 mg. W przypadku próbek tkanek większych niż 400 mg objętości odczynników muszą być odpowiednio zwiększane.
- Użyj 1 ml świeżego HBSS bez Ca2+ i Mg2+, aby przenieść pokrojone w kostkę kawałki tkanki za pomocą pipety do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Powtarzać kroki 2.1 i 2.2 dla wszystkich próbek, aż wszystkie próbki zostaną przeniesione do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
- Odwirować próbki o masie 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
- Dodać 1 900 μl ciepłej mieszanki enzymów 1, przygotowanej w krokach 1.2 i 1.3, do każdej próbki i zamknąć probówki.
- Inkubować próbki przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, kilkakrotnie odwracając probówki co 5 minut w celu ponownego zawieszenia osiadłych kawałków tkanki.
- W międzyczasie przygotuj mieszankę enzymów 2, mieszając 20 μl buforu Y z 10 μl rozmrożonego enzymu A (dla 4 próbek zmieszać 80 μl buforu Y z 40 μl rozmrożonego enzymu A).
- Dodać 30 μl Enzyme Mix 2 do każdej próbki i delikatnie odwrócić. Nie wirować.
- Oddziel każdą próbkę tkanki za pomocą pipety Pasteura "1", rozcierając ją w górę iw dół 30 razy.
- Inkubować próbki przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; odwracać probówki kilka razy co 5 minut, aby ponownie zawiesić osadzone kawałki tkanki.
- Dysocjację każdej próbki tkanki należy wykonać za pomocą pipety Pasteura "2", trzykrotnie rozcierając ją w górę i w dół, unikając tworzenia pęcherzyków.
- Oddziel każdą próbkę tkanki za pomocą pipety Pasteura "3", rozcierając ją w górę i w dół 30 razy, unikając generowania pęcherzyków.
- Inkubować próbki przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; odwracać probówki kilka razy co 5 minut, aby ponownie zawiesić osadzone komórki.
- Nałożyć zawiesinę jednokomórkową na 80-mikronowy szczep komórkowy umieszczony na 15 ml probówce Falcon w celu usunięcia wszelkich dużych kawałków zanieczyszczeń i umyć filtr i komórki 10 ml HBSS (z Ca2+ i Mg2+) w celu zatrzymania reakcji enzymatycznych. Powtarzać tę czynność, aż każda próbka zostanie przeniesiona do czystej probówki sokoła o pojemności 15 ml.
- Odwirować próbki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odessać z supernatantu.
3. Wyczerpanie mieliny (45 min)
- Dokładnie ponownie zawiesić osad komórek za pomocą 400 μl buforu do usuwania mieliny.
- Dodaj określoną ilość kulek do usuwania mieliny i pipetę w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać.
nuta: Objętość użytych kulek do usuwania mieliny będzie zależeć od wielkości tkanki, wieku zwierzęcia i ilości mieliny oczekiwanej w tym konkretnym regionie mózgu. Na przykład w przypadku próbki hipokampa dorosłego szczura (około 300 mg) należy inkubować próbkę ze 100 μl kulek do usuwania mieliny.
- Inkubować przez 15 minut w lodówce w temperaturze 4 °C.
- Przemyć każdą próbkę 5 ml buforu do usuwania mieliny.
- Odwirować próbki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Podczas wirowania próbek umieść 1 kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortownika magnetycznego i umieść czysty filtr o średnicy 80 mikronów na górze każdej kolumny.
- Przygotować kolumny i przefiltrować, przepłukując każdą kolumnę trzykrotnie 1 ml buforu do usuwania mieliny (łącznie 3 ml). Zbierz cały przepływ do pojemnika na odpady, takiego jak dno pustego pudełka na napiwki.
- Umieścić probówkę z okrągłym dnem o pojemności 5 ml polistyrenu bezpośrednio pod każdą kolumną w celu przygotowania do pobrania próbki.
- Gdy komórki zakończą wirowanie, odessać supernatant i dokładnie zawiesić go ponownie w 500 μl buforu do usuwania mieliny. Natychmiast nanieść zawiesinę komórek na kolumnę i zebrać komórki w probówce poniżej.
- Przemyć filtr i kolumnę 1 ml buforu do usuwania mieliny, 4 razy (łącznie 4 ml).
- Odwirować zbiór komórek przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant, a komórki są teraz gotowe do barwienia.
4. Barwienie żywych komórek dla FACS (1 godzina na barwienie)
- Krótko zawirować (2 sekundy) komórki w celu oddzielenia osadu i natychmiast dodać 5 μl bloku Fc (antyklastry różnicowania 32, CD32), ponownie zwirować i inkubować w lodówce w temperaturze 4 ºC przez 5 minut.
- W międzyczasie przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych, dodając trzy przeciwciała pierwszorzędowe do buforu płuczącego w następujący sposób: 0,125 μl przeciwciała CD11b sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) (1:800), 1 μl przeciwciała anty-GLT1 (1:100) i 0,4 μl izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) – sprzężonego przeciwciała Thy1 (1:250) na każde 100 μl buforu do płukania. Każda próbka otrzyma 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwotnych do inkubacji; Jeśli jednak próbka jest znacznie większa niż 400 mg tkanki, można rozważyć odpowiednie zwiększenie objętości mieszaniny przeciwciał pierwotnych
- Przygotuj probówki do pojedynczej kontroli barwienia, usuwając tylko 2 μl komórek z każdej probówki z próbką i dodając ją do każdej pojedynczej probówki do kontroli barwienia. Kontrole "pojedynczego barwienia" obejmują: tylko APC-CD11b, tylko GLT1, tylko FITC-Thy1, tylko przeciwciało wtórne PE oraz "ślepą" lub niebarwioną kontrolę.
nuta: Wszystkie próbki powinny być reprezentowane we wszystkich kontrolach barwienia, dlatego do każdej probówki kontrolnej należy dodać 2 μl komórek z każdej próbki.
- Krótko zawirować probówki (2 sekundy) i dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej probówki z próbką i 100 μl odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej probówki kontrolnej barwienia, ponownie zawirować probówki, przykryć probówki folią aluminiową w celu ochrony przeciwciał fluorescencyjnych przed światłem i inkubować probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Próbki powinny być przechowywane w chłodnym miejscu (w temperaturze 4 °C) przez pozostałą część procedury, aby zachować integralność próbek i przeciwciał.
- Krótko zmieszać probówki i dodać 2 ml buforu do przemywania każdej probówki.
- Probówki wirować o stężeniu 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- W międzyczasie należy przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych, dodając 0,2 μl sprzężonego z PE przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi na każde 100 μl buforu do płukania. Każda próbka otrzyma 100 μl mieszaniny przeciwciał wtórnych; Jeśli jednak próbka jest znacznie większa niż 400 mg tkanki, możesz rozważyć odpowiednie zwiększenie objętości podstawowej mieszaniny przeciwciał.
- Po zakończeniu wirowania zrzuć supernatant z każdej próbki do zlewu i osusz probówki do góry nogami na ręczniku papierowym.
- Krótko zawirować probówki i dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych do każdej probówki z próbką i odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do każdej kontroli barwienia. Następnie ponownie zwirować probówki, przykryć je folią aluminiową i inkubować w lodówce w temperaturze 4ºC przez 15 min.
nuta: Probówka kontrolna barwienia tylko GLT1 powinna otrzymać wtórną mieszaninę przeciwciał.
- Po inkubacji krótko zawirować probówki i dodać 2 ml buforu do przemywania każdej probówki.
- Odwirować probówki o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4ºC.
- Po zakończeniu wirowania zrzuć supernatant z każdej próbki do zlewu i osusz probówki do góry nogami na ręczniku papierowym.
- Zmieszać probówki i dodać 0,25 ml sterylnego PBS do każdej probówki. Próbki są gotowe do sortowania.
nuta: Więcej komórek może wymagać 0,5 ml sterylnego PBS; Najlepiej jednak zacząć od mniejszej objętości, ponieważ próbkę zawsze można rozcieńczyć, jeśli jest zbyt skoncentrowana na komórkach.
nuta: Opcjonalnie dodaj DNazę do probówki, aby zapobiec zbrylaniu się komórek, a tym samym zatykaniu sortera. Próbki mogą być również filtrowane za pomocą sterylnego filtra o grubości 80 mikronów tuż przed sortowaniem, aby uniknąć zatkania sortownika.
