Izolacja neuronów z Caenorhabditis elegans poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Streszczenie

Źródło: Niemcy, E. M., et al. Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje izolację fluorescencyjnie znakowanych neuronów od Caenorhabditis elegans. Zawiesinę komórkową uzyskuje się z transgenicznych robaków zaprojektowanych do ekspresji fluorescencyjnych, połączonych z białkiem transbłonowym transporterów pęcherzykowych w neuronach cholinergicznych. Znakowane fluorescencyjnie neurony są następnie izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i utrzymywane w hodowli.

Protokół

1. Przygotowanie i zbieranie starych robaków do izolacji komórek

1. Zbierz robaki i przygotuj do izolacji komórek.
   1. Zbierz robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć robaki z płytki 1,5 ml buforu M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 22 mM KH₂PO₄, pH 7,0) i wirować przez 5 minut przy 1,600 x g. Odrzucić supernatant i przemyć robaki 1 ml buforu M9. Powtórz wirowanie i umyj w sumie pięć razy, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń Escherichia coli.
      UWAGA: Dodanie antybiotyków (50 μg/ml), takich jak ampicylina, na tym etapie może pomóc w zmniejszeniu zanieczyszczenia bakteryjnego.
   2. Dla dwóch próbek należy przygotować 2 ml buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu i ditiotreitolu (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego) (pH 8,0) i 3% (w/v) sacharozy.
   3. Przygotować 15 ml buforu izolacyjnego (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7,3]) i przechowywać go na lodzie.
      nuta: Zarówno bufor do lizy SDS-DTT, jak i bufor izolacyjny muszą być świeże przed każdym doświadczeniem.
2. Przerwanie naskórka i izolacja pojedynczej komórki
   1. Odwirować zwierzęta zebrane w kroku 1.1.1 przez 5 minut przy 1 600 x g. Usunąć cały supernatant i zawiesić robaki w 1 ml pożywki M9 i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   2. Robaki granulowane z odwirowaniem w ilości 1 600 x g przez 5 min.
   3. Dodać 200 μl buforu do lizy SDS-DTT do robaków i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Robaki powinny wydawać się "zmarszczone" wzdłuż ciała, jeśli są oglądane pod mikroskopem świetlnym.
      nuta: Długotrwałe narażenie na bufor do lizy SDS-DTT może spowodować śmierć robaków, co można monitorować obserwując robaki. Robaki, które są martwe, wydłużają się i nie zwijają się.
   4. Dodać 800 μl lodowatego buforu izolacyjnego i wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę.
   5. Robaki osadzać przez 1 minutę w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i przemyć 1 ml buforu izolacyjnego.
   6. Powtórz krok 1.3.5 w sumie pięć razy, za każdym razem ostrożnie usuwając bufor izolacyjny.
   7. Dodać 100 μl mieszaniny proteazy ze Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabela materiałów) rozpuszczonej w buforze izolacyjnym do osadu i inkubować przez 10−15 min w temperaturze RT.
      nuta: Podobnie jak w przypadku buforu do lizy SDS-DTT, przedłużone trawienie proteazy może powodować nadmierne rozszczepianie białek wzdłuż błony plazmatycznej, uniemożliwiając izolację odsłoniętego powierzchniowo białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą kulek magnetycznych.
   8. Podczas inkubacji z mieszaniną proteazy należy zastosować mechaniczne zakłócenie, pipetując próbki w górę iw dół do dna probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 200 μl ~60−70 razy. Przyłóż końcówkę pipety do ścianki probówki mikrowirówki pod stałym ciśnieniem, aby prawidłowo oddzielić komórki.
   9. Aby określić etap trawienia, należy usunąć niewielką objętość (~1−5 μl) mieszaniny mineralizującej, upuścić ją na szkiełko podstawowe i sprawdzić za pomocą mikroskopu do hodowli tkankowych. Po 5-7 minutach inkubacji fragmenty robaka powinny mieć widocznie zredukowany naskórek, a zawiesina komórek będzie łatwo widoczna.
   10. Zatrzymaj reakcję z 900 μl dostępnej na rynku zimnej pożywki L-15 firmy Leibovitz uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną (końcowe stężenie przy 50 μg/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny).
   11. Izolowane fragmenty i komórki osadów należy odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Umyć granulowane komórki jeszcze dwukrotnie 1 ml zimnej pożywki z dodatkiem L-15, aby upewnić się, że nadmiar zanieczyszczeń i naskórka zostały usunięte.
   12. Zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki z dodatkiem L-15 i pozostawić na lodzie na 30 minut. Weź górną warstwę, około 700−800 μl, do probówki mikrowirówkowej. Warstwa ta zawiera komórki bez szczątków komórkowych i zostanie wykorzystana w późniejszej izolacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.
   13. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby zmierzyć gęstość komórek 10−25 μl izolowanych komórek.

2. Izolacja komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej

1. Izolacja komórek GFP-dodatnich metodą cytometrii przepływowej
   1. Z wyizolowanej zawiesiny komórkowej zebranej w kroku 1.2.12 odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić granulowane komórki w pożywce z dodatkiem L-15 do gęstości komórek nie większej niż 6 x 10⁶ komórek/ml, aby uniknąć przeciążenia cytometru przepływowego.
   2. Sortować komórki według ekspresji GFP-dodatniej przy użyciu cytometru przepływowego zdolnego do sortowania próbek. Komórki GFP-ujemne mogą być używane jako kontrola do analizy niespecyficznej dla typu komórki.
2. Hodowla izolowanych komórek
   1. Umieść izolowane komórki na sterylnej 6-dołkowej płytce wielodołkowej.
      nuta: Płytki te mogą być pokryte lektyną z orzeszków ziemnych w celu zwiększenia przyczepiania komórek; Jeśli jednak komórki mają być użyte natychmiast, ten krok może zostać pominięty.
   2. Umieścić płytkę w plastikowym pojemniku i inkubować komórki w temperaturze 20 °C za pomocą wilgotnej chusteczki lub miękkiej bibułki (dodać 50 μg/ml ampicyliny do podwójnie destylowanej wody [ddH₂O], aby upewnić się, że nie rozwijają się bakterie na chusteczce), aby dodać wilgoci do komórek. Nie inkubować w inkubatorze CO_{2 ,} ponieważ podwyższony poziom CO₂ może uszkodzić komórki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 6-dołkowa	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-556-004
Agar, klasa biologii molekularnej	Firma VWR	Nr kat. A0930
CaCl2	Sigma	Zobacz materiał C5670
Contess Automatyczny licznik komórek	Invitrogen	Z359629
Naziemna telewizja	USBiological	Zobacz materiał D8070
FBS (Sieć Usługowa	Omega Naukowa	FB-02
HEPESY	Sigma	H3375
Kcl	Amresco (angielski)	O395
KH2PO4	USBiological	Zobacz materiał P5110
Chusteczki Kimwipes	Profesjonaliści Kimberly-Clark	7552
L-15 Średni Leibovitz	Gibco (firma Gibco)	21083027
MgCl2	Sigma	Zobacz materiał M8266
MgSO4	USBiological	Zobacz materiał M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	Zobacz materiał S5199
Zawartość NaCl	Firma VWR	Zobacz materiał X190
NaOCl (wybielacz)	Clorox
NaOH	Amresco (angielski)	Numer telefonu O583
Penicylina-Streptomicen	Fisher Naukowy	15140122
Pepton Y	USBiological	Zobacz materiał P3306
Pronase E	Sigma	7433	mieszanina proteaz ze Streptomyces griseus
Sds	Amresco (angielski)	O227
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny SMT1-FLQC	Badania Tritech
sacharoza	USBiological	Zobacz materiał S8010

cyfrowa powiedział: powiedział: Pokój powiedział: powiedział: Pokój powiedział: