Uzyskiwanie plastrów móżdżku z embrionalnego mózgu pisklęcia

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Sekcja zarodka kurczaka Dzień 14 (e14) Móżdżek

1. Inkubować brązowe zapłodnione jaja kurze w temperaturze 38 °C do 14. dnia zarodka.
2. Za pomocą nożyczek do jaj odetnij głowę zarodkowi pisklęcia in ovo i przenieś głowę na szalkę Petriego zawierającą lodowaty bufor fosforanowy z solą fizjologiczną (PBS) (ryc. 1A).
3. Za pomocą standardowych kleszczy wykonaj nacięcia za każdym okiem na całej długości tkanki, usuwając oczy i górną szczękę. Wykonaj drugie nacięcie przez gardło, usuwając dolną szczękę (ryc. 1B).
4. Za pomocą standardowych kleszczy usuń całą skórę z powierzchni czaszki, odrywając ją (ryc. 1C) i usuń kości czołowe i ciemieniowe, odsłaniając mózg.
5. Od strony brzusznej usuń chrząstkę gardłową i mezenchymę pomocniczą.
6. Od strony grzbietowej ostrożnie usuń mezenchymę grzbietową do tyłomózgowia, uważając, aby nie uszkodzić pia, i oddziel cały mózg (ryc. 1D).
7. Wykonaj nacięcie na całej długości tkanki między śródmózgowiem a tyłomózgowiem i oddziel tyłomózgowie, w tym móżdżek (ryc. 1E).
8. Usuń cały móżdżek, wykonując nacięcia na całej długości tkanki w obu bocznych połączeniach móżdżku i płytki alarowej tyłomózgowia, dbając o zachowanie integralności pia przez cały okres rozwarstwienia (ryc. 1F). Usuń również tworzący się splot naczyniówkowy (ryc. 1G).
9. Przenieś wypreparowany móżdżek do lodowatego roztworu soli Hanka (HBSS).

2. Kultura Slice móżdżku e14

1. Przenieś cały móżdżek na sterylną platformę rozdrabniacza tkanek za pomocą szpatułki lub pipety Pasteura o pojemności 3 ml z odciętą końcówką w celu poszerzenia otworu. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety.
2. Wytnij cały móżdżek w wymaganej orientacji o grubości 300 μm za pomocą zestawu rozdrabniacza tkanek z prędkością cięcia 50% maksimum. Integralność tkanek jest najłatwiej zachowana w przekroju strzałkowym; jednak orientacja jest również ważnym czynnikiem w analizie komórek (dendryty komórek Purkinjego są wyrównane strzałkowo, podczas gdy aksony komórek ziarnistych biegną poprzecznie, prostopadle do płaszczyzny dendrytów komórek Purkinjego).
3. Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml przykryj pokrojony móżdżek w lodowatym HBSS.
4. Przenieść plastry z HBSS na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą lodowato świeży HBSS za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml z odciętą końcówką.
5. Pod mikroskopem preparacyjnym oświetlonym światłowodowym źródłem światła należy oddzielić poszczególne plastry za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich.
   nuta: Każda sekcja, od zarodka do inkubacji plastrów w pożywce, trwa około 10-20 minut, w zależności od doświadczenia. Wykonuj sekcje pojedynczo, aby upewnić się, że móżdżek spędza jak najmniej czasu między dekapitacją a posiewem ex vivo.

Rysunek 1. Wypreparowanie móżdżku z zarodków piskląt E14. (A) Odciąć głowę pisklęciu w jaju i wyjąć głowę na szalkę Petriego z lodowatym PBS. Usuń dolną szczękę i oczy, wykonując nacięcie za oczami i gardłem (linia przerywana). (B) Usunąć skórę z powierzchni czaszki. (C) Usunąć kości czołowe i ciemieniowe, oraz (D) usunąć mózg z mezenchymy i otaczającej go chrząstki. (E) Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj lokalizację móżdżku na tylnym końcu mózgu. Przecięcie między śródmózgowiem a tyłomózgowiem (linie przerywane), aby pozostać z móżdżkiem i brzuszną tyłomózgowiem. (F) Wykonaj nacięcia na bocznych połączeniach (szypułkach) móżdżku, aby oddzielić móżdżek od tyłomózgowia (linia przerywana). (G) Usuń splot naczyniówkowy (gwiazdkę) z brzusznej strony móżdżku, aż pozostanie z całym nienaruszonym móżdżkiem z przyczepionym pia. Przenieś móżdżek do lodowatego HBSS przed przygotowaniem plastrów za pomocą rozdrabniacza do tkanek.