Ustanawianie pierwotnych mieszanych kultur komórek glejowych z rdzenia kręgowego myszy

Streszczenie

Źródło: Malon, J. T., et al. Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych mieszanych komórek glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Protokół obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki, a następnie usunięcie uszkodzonych błon komórkowych i resztek mieliny w celu uzyskania populacji pojedynczej komórki. Komórki są następnie hodowane w pożywkach zoptymalizowanych pod kątem wzrostu mieszanych komórek glejowych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów w kapturze hodowlanym w warunkach aseptycznych

1. Przygotować pożywkę hodowlaną: pełną modyfikację Dulbecco pożywki Eagle'a (cDMEM) zawierającej DMEM (z 4,5 g/l glukozy), 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminę, 100 j.m./ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 250 ng/ml amfoterycyny B i 50 μM 2-merkaptoetanolu (2-ME; patrz 1.1.1). Wymieszaj i przefiltruj, wysterylizuj wszystkie inne składniki, a następnie dodaj FBS. Przechowywać pożywkę hodowlaną w temperaturze 4 ^°C.
   1. Przygotować 50 mM roztworu podstawowego 2-ME/soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS): dodać 100 μl stężonego 2-ME (14,3 M) do 28,6 ml 1x PBS i sterylizować filtrem (roztwór można przechowywać w temperaturze 4 ^°C przez kilka miesięcy). Użyć 1 ml roztworu podstawowego 2-ME na każde 1 000 ml pożywki hodowlanej.
2. Przygotowanie ośrodków o gradionym gradiencie gęstości
   1. Przygotuj podstawowy roztwór gradientu gęstości izotonicznej (np. 100% Percoll) z 1 części 10x zwykłego sterylnego PBS i 9 części sterylnych pożywek gradientowych o gęstości materiału (np. Percoll).
   2. Rozcieńczyć pożywkę o gradinie o 100% gęstości (wykonaną w ppkt 1.2.1) zwykłym 1x sterylnym PBS, aby uzyskać pożywkę o gradinie o gęstości 20% (np. 10 ml pożywki o gradinie o 100% gęstości z 40 ml 1x PBS) i przechowywać ją w temperaturze 4 ^°C. Doprowadź pożywkę o gradinie o gęstości 20% do temperatury pokojowej (RT) przed przygotowaniem hodowli komórkowej.
3. Przygotowanie roztworów z systemu dysocjacji papainy
   UWAGA: System dysocjacji papainy można zidentyfikować w Tabeli Materiałów. Można również stosować inne podobne zestawy dysocjacyjne (w tym te montowane we własnym zakresie). Wszystkie składniki muszą być sterylne.
   1. Dodać 32 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) do mieszaniny inhibitorów ovomukoidów (proszek).
   2. Dodać 5 ml EBSS do jednej fiolki z papainą (proszek). Umieścić fiolkę z papainą w łaźni wodnej o temperaturze 37 ^°C na 10 minut lub do momentu rozpuszczenia papainy.
   3. Dodać 500 μl EBSS do jednej fiolki (proszek) DNazy. Delikatnie wymieszaj.
   4. Dodać 250 μl roztworu DNazy (powyżej) do fiolki z papainą.
   5. Obliczyć całkowitą ilość powyższej mieszaniny papainy/DNazy (około 800 μl mieszaniny papaina/DNaza na rdzeń kręgowy myszy) i przenieść potrzebną mieszaninę do probówki o pojemności 50 ml w celu trawienia tkanek. Resztki należy przechowywać w oryginalnej fiolce w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa tygodnie.
   6. Trzymaj wszystkie elementy z zestawów na lodzie, aż będą potrzebne.
4. Przygotuj probówki do pobierania rdzenia kręgowego: jedną sterylną probówkę o pojemności 15 ml z 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS; z systemu dysocjacji papainy, do pobierania rdzenia kręgowego) i jedną sterylną probówkę o pojemności 15 ml z 1x PBS (do napełniania strzykawki o pojemności 5 ml). Ponadto należy przygotować jedną sterylną szalkę Petriego (35 mm lub 60 mm) z 5 ml HBSS i przechowywać ją w okapie hodowlanym.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

Uwaga: Wykonaj kroki 3 i 4 w kapturze hodowlanym, aby wszystko było sterylne.

1. Przenieś wszystkie rdzenie kręgowe na szalkę Petriego zawierającą HBSS. Pokrój każdy z rdzeni kręgowych na wiele cienkich, małych kawałków za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Przenieść tkankę rdzenia kręgowego do stożkowej rurki o pojemności 50 ml zawierającej przygotowaną mieszaninę papainy/enzymu DNazy (krok 1.3.5) za pomocą sterylnych kleszczyków lub pipety o pojemności 10 ml (należy unikać dodawania HBSS do mieszaniny enzymów, ponieważ spowoduje to dalsze rozcieńczenie przygotowanego roztworu enzymu i może spowodować zmniejszenie działania enzymu).
2. Delikatnie przekręć rurkę, aby wymieszać. Inkubować probówkę w temperaturze 37 ^oC przez 1 godzinę w inkubatorze/wytrząsarce z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min.
3. Ponownie przemieszać probówkę i energicznie rozprowadzić roztwór enzymu z tkanką za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby przyspieszyć dalszą dysocjację.
4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Podczas wirowania zmieszać 2,7 ml EBSS z 300 μl odtworzonego roztworu inhibitora albuminy i owomukoidów (1.3.1) w sterylnej probówce. Dodać 150 μl roztworu DNazy (krok 1.3.3).
6. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z roztworem przygotowanym powyżej (krok 1.5). Dobrze wywiruj, aby rozbić osad komórkowy.
7. Dodać 3 ml odtworzonego roztworu inhibitora albuminy i owomukoidów (krok 1.4.1) do zawiesiny komórkowej. Odwirować komórki przy 70 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant (który zawiera fragmenty błony).

3. Dalsze usuwanie mieliny z zawiesiny pojedynczej komórki

1. Dodać 8 ml pożywki o gradiencie gęstości 20% (przygotowanej w kroku 1.2.2) do probówki zawierającej osad komórkowy, delikatnie przetrząsnąć, aby rozbić osad i odwirować komórki przy 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamowania. Ostrożnie usunąć wierzchnią warstwę zanieczyszczeń (głównie mielinę) i supernatant, ale zachować osad.
2. Aby usunąć pozostałości gradientu gęstości, umyj komórki, ponownie zawieszając osad komórek z 8 ml rozcieńczonego cDMEM (1 część cDMEM i 2 części HBSS). Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ^oC. Usunąć supernatant i ponownie przemyć komórki rozcieńczonym cDMEM (powyżej) w ten sam sposób. Trzymaj komórki na lodzie, aż je wysiejesz.
3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej (cDMEM dostarczony z 2-ME (przygotowanym w kroku 1.1)). Na jedną płytkę 12-dołkową należy użyć 3 ml x 4 (liczba użytych myszy) + 2 ml = 14 ml pożywki. Zapewni to wystarczającą ilość zawiesiny komórek na całej płytce (12 dołków) i zapewni dodatkowe studzienki, które można wykorzystać do określenia średniej liczby komórek w basenie i zawartości mikrogleju w hodowli. Jeżeli będą używane inne rodzaje naczyń hodowlanych, należy proporcjonalnie obliczyć całkowitą objętość potrzebnych pożywek hodowlanych.
4. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
5. Inkubować komórki w temperaturze 35,9 ^oC z 5% CO₂ .
6. Zmień pożywkę (usuń stare pożywki przez aspirację) na D 1, a następnie co 3 - 4 dni (zwykle zmień pożywkę na D: 1, 4, 8 i 11, a następnie użyj komórek w 12 dniu).
   nuta: W dniu 1 hodowla może zawierać znaczne ilości szczątków spowodowanych pozostałościami mieliny z tkanki rdzenia kręgowego; Dlatego zaleca się zmianę podłoża w dniu 1. Kultury są gotowe do leczenia między D 12 - 14. Komórki zwykle zlewają się w 80% w D 12 i mogą być bliskie 100% zlewają się w D 14. Zazwyczaj na D 12 w 12-dołkowej płytce znajduje się około 100 000 komórek na studzienkę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Modyfikacja pożywki Eagle'a (DMEM) przez Dulbecco z 4,5 g/l glukozy	Lonza	12-709F	Pożywka cDMEM jest standardowym, szeroko stosowanym podłożem hodowlanym. Poszczególni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić DMEM i wszystkie inne komponenty używane do produkcji nośników cDMEM.
L-Glutamina (100x)	Lonza	17-605E	L-glutamina jest standardowym, szeroko stosowanym składnikiem różnych pożywek hodowlanych. Indywidualni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić L-glutaminę.
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)	Firma Corning-Mediatech	30-004-CI	Jest to kombinacja penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny, która zawiera 10 000 jednostek/ml penicyliny G, 10 mg/ml siarczanu streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B. Poszczególni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić poszczególne składniki.
2-merkaptoetanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M3148	Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych, biologii molekularnej i elektroforezy.
System dysocjacji papainy	Korporacja Biochemiczna Worthington	LK003150	Poszczególne elementy tego zestawu można zakupić osobno.
Percoll	GE Opieka zdrowotna	Numer katalogowy: 17-0891-01	Percoll jest sprzedawany w postaci sterylnego roztworu. Nierozcieńczony Percoll można w razie potrzeby ponownie sterylizować w autoklawie.
Inkubator/wytrząsarka laboratoryjna	Linia Barstead/Lab-line	Maksimum Q4000	To jest inkubator/wytrząsarka, którą obecnie posiadamy. Zamiast tego można użyć innych rodzajów wytrząsarek.

powiedział: