Ustanawianie pierwotnych mieszanych kultur komórek glejowych z rdzenia kręgowego myszy

Streszczenie

Źródło: Malon, J. T., et al. Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych mieszanych komórek glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Protokół obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki, a następnie usunięcie uszkodzonych błon komórkowych i resztek mieliny w celu uzyskania populacji pojedynczej komórki. Komórki są następnie hodowane w pożywkach zoptymalizowanych pod kątem wzrostu mieszanych komórek glejowych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów w kapturze hodowlanym w warunkach aseptycznych

1. Przygotować pożywkę hodowlaną: pełną modyfikację Dulbecco pożywki Eagle'a (cDMEM) zawierającej DMEM (z 4,5 g/l glukozy), 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminę, 100 j.m./ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 250 ng/ml amfoterycyny B i 50 μM 2-merkaptoetanolu (2-ME; patrz 1.1.1). Wymieszaj i przefiltruj, wysterylizuj wszystkie inne składniki, a następnie dodaj FBS. Przechowywać pożywkę hodowlaną w temperaturze 4 ^°C.
   1. Przygotować 50 mM roztworu podstawowego 2-ME/soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS): dod....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Modyfikacja pożywki Eagle'a (DMEM) przez Dulbecco z 4,5 g/l glukozy	Lonza	12-709F	Pożywka cDMEM jest standardowym, szeroko stosowanym podłożem hodowlanym. Poszczególni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić DMEM i wszystkie inne komponenty używane do produkcji nośników cDMEM.
L-Glutamina (100x)	Lonza	17-605E	L-glutamina jest standardowym, szeroko stosowanym składnikiem różnych pożywek hodowlanych. Indywidualni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić L-glutaminę.
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)	Firma Corning-Mediatech	30-004-CI	Jest to kombinacja penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny, która zawiera 10 000 jednostek/ml penicyliny G, 10 mg/ml siarczanu streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B. Poszczególni badacze mogą zdecydować, gdzie kupić poszczególne składniki.
2-merkaptoetanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M3148	Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych, biologii molekularnej i elektroforezy.
System dysocjacji papainy	Korporacja Biochemiczna Worthington	LK003150	Poszczególne elementy tego zestawu można zakupić osobno.
Percoll	GE Opieka zdrowotna	Numer katalogowy: 17-0891-01	Percoll jest sprzedawany w postaci sterylnego roztworu. Nierozcieńczony Percoll można w razie potrzeby ponownie sterylizować w autoklawie.
Inkubator/wytrząsarka laboratoryjna	Linia Barstead/Lab-line	Maksimum Q4000	To jest inkubator/wytrząsarka, którą obecnie posiadamy. Zamiast tego można użyć innych rodzajów wytrząsarek.

powiedział: