Różnicowanie komórek progenitorowych oty w komórki nabłonka czuciowego, a następnie barwienie immunologiczne

Streszczenie

Źródło: Azadeh, J. et al., Inicjowanie różnicowania w unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórkach progenitorowych uszu.J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje różnicowanie się unieśmiertelnionych komórek progenitorowych im. multipotencjalnych komórek otycznych (iMOP) w komórki nabłonka czuciowego. Przedstawia etapy związane z hodowlą komórek iMOP, tworzeniem otosfer, indukowaniem różnicowania oraz wizualizacją składników komórkowych i markerów różnicowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu potwierdzenia pomyślnego różnicowania komórek.

Protokół

1. Utrzymanie samoodnawiania się w komórkach IMOP

1. Przygotować pożywki hodowlane iMOP: DMEM/F12, 1X suplement B27, 25 μg/ml karbenicyliny i 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Przygotować 50 ml pożywki hodowlanej iMOP za pomocą sterylnych odczynników. Rozgrzej 49 ml DMEM/F12 w stożkowym 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   1. Rozmrozić 50X suplement B27 i wysterylizowane filtrem 100 mg/ml podwielokrotności karbenicyliny przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozmrozić 100 μg/ml podwielokrotności bFGF w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml 50X B27, 10 μl 100 μg/ml bFGF i 12,5 μl 100 mg/ml karbenicyliny do DMEM/F12.
2. Użyć 3 ml pożywki w naczyniu do hodowli tkanek o średnicy 60 mm do hodowli komórek iMOP. Dodawaj świeże pożywki do kultur co drugi dzień, podwajając objętość pożywki. Upewnij się, że stężenie bFGF nie spadnie poniżej 5 ng/ml.
   1. Hodowla komórek iMOP w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .} Przejście komórek w kulturze po 5 - 7 dniach, jak podano w poniższych krokach. Przenieść kulturę do stożka o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 ml.
3. Wykonać 1 mM EDTA w HBSS, rozcieńczając 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 w 50 ml HBSS. Wstępnie ogrzany 1 mM EDTA wykonany w HBSS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Zbierać komórki przez sedymentację grawitacyjną lub odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W celu sedymentacji grawitacyjnej umieścić stożkowy pojemnik o pojemności 15 ml zawierający kultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5–10 minut. Po tym czasie obserwuj, jak otosfery zbierają się na dnie stożkowego 15 ml.
   nuta: Nadmierna siła odśrodkowa może spowodować uszkodzenie komórek.
5. Ostrożnie odessać zużytą pożywkę za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać 0,5 ml wstępnie podgrzanego 1 mM ROZTWORU EDTA HBSS do osadu komórkowego. Za pomocą pipety P1000 delikatnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy. Umieścić stożkowy w temperaturze 37 °C i inkubować przez <5 minut, aby ułatwić dysocjację na pojedyncze komórki.
6. Delikatnie zamieszaj roztwór komórkowy, aby określić, czy otosfery są zdysocjowane. Jeśli żadne otosfery nie osadzają się na dnie stożka, komórki są dysocjowane. Czas inkubacji może się różnić.
   nuta: Długotrwała inkubacja z EDTA spowoduje nadmierną śmierć komórki.
7. Usunąć komórki z temperatury 37 °C, dodać 2 ml pożywki w celu zneutralizowania i rozcieńczenia EDTA. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać rozcieńczony EDTA za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml i dodać 5 ml 1X PBS w celu przepłukania komórek.
8. Odwiruj komórki w dół przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessaj 1X PBS za pomocą pipety aspirującej 2 ml. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000 w 0,5 ml pożywki hodowlanej iMOP, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
9. Policz komórki za pomocą mikroprzepływowego licznika cząstek z odpowiednimi kasetami. Zlewająca się płytka komórek iMOP będzie zawierała ~6 X10⁶ komórek. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:100 w pożywce i dodać 75 μl roztworu komórek do kasety w celu zliczenia. Płytka 1 x 10⁶ komórek w naczyniu o średnicy 6 cm w pożywce hodowlanej iMOP (rozcieńczenie ~1:10). Przejazd iMOP co 5 - 7 dni.
   nuta: Komórki, które tworzą duże otosfery lub przyczepiają się do dna naczynia do hodowli tkankowej, będą się różnicować. Komórki umrą również, jeśli kultury będą nadmiernie zlewać się.

2. Różnicowanie komórek IMOP w nabłonek czuciowy

1. Przygotować 50 ml pożywki do różnicowania nabłonka czuciowego iMOP: DMEM/F12, 1X suplement B27, 25 μg/ml karbenicyliny. Przygotować 50 ml pożywki do różnicowania nabłonka czuciowego iMOP. Rozgrzej 49 ml DMEM/F12 w stożkowym 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozmrozić 50 razy więcej suplementu witaminy B27 i 100 mg/ml porcji karbenicyliny przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 1 ml 50X B27 i 12,5 μl 100 mg/ml karbenicyliny do DMEM/F12.
2. Aby zebrać, rozdzielić, ponownie zawiesić i policzyć komórki, powtórz kroki 1.4-1.9
3. Płytka 1 x 10⁶ komórek w naczyniu o średnicy 6 cm w dniu -3 przy użyciu pożywki hodowlanej iMOP. W dniu 0 przenieść kultury za pomocą pipety o pojemności 10 ml do stożkowego 15 ml. Zebrać otosfery przez sedymentację grawitacyjną, jak podano w kroku 1.6. Odessać zużyte podłoże za pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml i pozostawić otosfery na dnie stożka.
4. Delikatnie dodać 2 ml pożywki do różnicowania nabłonka czuciowego. Przenieść otosfery do naczynia o średnicy 6 cm za pomocą pipety o dużym otworze i pojemności 10 ml.
   nuta: Mechaniczne ścinanie spowodowane ostrym pipetowaniem może oddzielić komórki od otosfer
.
5. Co drugi dzień dodawać 2 ml świeżej pożywki do różnicowania nabłonka sensorycznego do hodowli. W razie potrzeby komórki można pobrać przez sedymentację grawitacyjną i wymienić pożywki.
6. Zebrać otosfery w dniu 10, przenosząc do stożkowego pojemnika o pojemności 15 ml i pozwalając otosferom otosferycznie, aby osiadły, jak podano w kroku 1.6. Odessać zużyte podłoże za pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml i pozostawić otosfery w spokoju.
7. Utrwal otosfery poprzez inkubację w 4% formaldehydzie w 1X PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór formaldehydu i przemyj otosfery buforem do przemywania (1X PBS zawierający 0,1% TritonX-100) przed inkubacją w buforze blokującym (1X PBS zawierający 10% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100) przez 1 godzinę.
   1. Zastąp bufor i inkubuj próbki w buforze blokującym rozcieńczonym przeciwciałem. Inkubować w temperaturze 4 °C. Przemyć próbki 1X PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 i poddać otosferę barwieniu immunologicznemu. Przenieś otosfery do 1X PBS i umieść otosfery w pożywkach montażowych na szkiełku podstawowym za pomocą pipety P1000. Nałożyć szkiełko nakrywkowe na próbkę i pozostawić podłoże montażowe do wyschnięcia w temperaturze 4 °C.
8. Uzyskuj obrazy epifluorescencyjne za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w 16-bitową kamerę CCD i obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 20X 0,75 lub 40X 1,3 NA. Zbieraj fluorescencję z różnych kanałów kolorystycznych za pomocą podanych długości fal (wzbudzenie i emisja): niebieski (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), zielony (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), czerwony (562 ± 20 nm/ i 625 ± 20 nm) oraz podczerwony (628 ± 20 nm/ i 692 ± 20 nm).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 mm (okrągłe 12 mm)	Nauki o mikroskopii elektronowej	Nr kat. 72230-01
DMEM/F12	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11320-082
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10010-023
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 14025-092
Suplement B27 (50X) Bez surowicy	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17504-044	Przechowywany w postaci podwielokrotności 1 ml
Mocowanie przeciwblaknięcie Prolong Gold	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 47743-736	Przechowywany w postaci podwielokrotności 10 mg/ml 100 μl
Moxi Z Mini Automatyczny licznik komórek	Orflo	MXZ001
Kaseta Moxi Z Typ S	Orflo	MXC002
Rekombinowany mysi czynnik wzrostu fibroblastów, zasadowy (bFGF)	Peprotech	450-33 Rozdział 450-33	Zawieszony w 0,1% BSA w H20 i przechowywany jako podwielokrotności 20 mg/ml
Karbenicylina, sól disodowa	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP2648-1	Zawieszony w 10 mM Hepes o pH 7,4 i przechowywany w postaci podwielokrotności 100 mg/ml
Pipta 5 ml, pakowana pojedynczo, miękka okładka (200 sztuk w opakowaniu zbiorczym)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 1367811D
Pibuła 10 ml pakowana pojedynczo w miękką okładkę (200 sztuk w opakowaniu zbiorczym)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 1367811E
Naczynie 6 cm poddane hodowli tkankowej	Thermo Fisher Naukowy	130181
Końcówki do pipet filtrów TipOne 0,1-10 ul wydłużona końcówka filtra	USA Naukowe	Nr kat. 1120-3810
Końcówki do pipet filtra TipOne 1-20 ul końcówka filtra	USA Naukowe	Lata 1120-1810
Końcówki do pipet filtra TipOne 1-200 ul końcówka filtra	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1120-8810
Końcówki do pipet filtra TipOne 101-1000 ul końcówka filtra	USA Naukowe	Nr kat. 1126-7810
Probówki stożkowe 15 ml sterylne 20 worków po 25 probówek (500 probówek)	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1475-0511
Probówki stożkowe 50 ml sterylne 20 worków po 25 probówek (500 probówek)	USA Naukowe	Lata 1500-1211