Różnicowanie unieśmiertelnionych multipotencjalnych progenitorów otycznych w neurony zwojowe spiralne i ocena różnicowania

Streszczenie

Źródło: Azadeh, J., et al. Inicjowanie różnicowania w unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórkach progenitorowych uszu. J. Vis. Exp. (2016).

Wideo pokazuje różnicowanie się unieśmiertelnionych multipotencjalnych komórek progenitorowych (iMOPs) w spiralne neurony zwojowe (SGN) i immunofluorescencyjne potwierdzenie różnicowania. iMOPy są siane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych substratem hodowlanym w pożywce różnicującej neurony w celu różnicowania w SGN. Zróżnicowane komórki są znakowane przeciwciałami specyficznymi dla markerów różnicowania neuronów i analizowane pod mikroskopem w celu potwierdzenia różnicowania.

Protokół

1. Różnicowanie neuronów pochodzących z iMOP

1. Przygotuj 50 ml pożywki różnicującej neurony: pożywki neuropodstawne, 1X suplement B27, 2 mM L-glutamina. Rozmrażaj butelkę z 50X B27 i 200 mM L-Glutaminą w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodaj 1 ml 50X B27 i 0,5 ml 200 mM L-Glutaminy do 48,5 ml pożywki Neurobase.
2. Pokryj szkło nakrywkowe, umieszczając 12 mm okrągłe szkiełka nakrywkowe 1,5 szklanego na sterylnej płytce o średnicy 10 cm i dodaj 70% etanolu (EtOH) do płytki, aby wysterylizować i oczyścić szkiełka nakrywkowe.
3. Delikatnie potrząśnij szkiełkami nakrywkowymi, aby upewnić się, że są pokryte etanolem. Pozostaw płytkę na 10 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz szkiełka nakrywkowe 3 razy sterylną solą fizjologiczną 1X buforowaną fosforanem (PBS), aby wypłukać pozostały etanol. Opłucz szkiełko nakrywkowe raz sterylnym_H2O, aby wypłukać pozostałą 1X PBS.
4. Odessać_H2Oza pomocą pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia. Wystawić szkiełka nakrywkowe na działanie promieniowania UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w sterylnym miejscu, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
5. Umieścić jedno okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm w każdym dołku naczynia z 24 dołkami. Delikatnie potrząśnij talerzem, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe leżą płasko na dnie studzienki.
6. Rozmrozić 2 mg/ml roztworu podstawowego poli-D-lizyny w temperaturze pokojowej (RT) i rozcieńczyć do stężenia 10 μg/ml poli-D-lizyny w 1X PBS. Dodać 0,25 ml 10 ug/ml poli-D-lizyny do studzienek. Pozostawić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
7. Umyj studzienki 3 razy sterylnym 1X PBS. Rozmrozić 10 mg/ml roztworu podstawowego lamininy w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć do 10 μg/ml w 1X PBS. Dodać 0,25 ml roztworu roboczego 10 μg/ml lamininy do pojedynczego dołka w 24-dołkowym naczyniu. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odessać roztwór lamininy za pomocą pipety aspirującej o pojemności 2 ml.
8. Przemyć szkiełko nakrywkowe 3 razy za pomocą 1X PBS, dodając 1 ml 1X PBS za pomocą pipety P1000 i usuwając 1X PBS przez zasysanie pipetą 2 ml. Pozostaw 1X PBS z ostatniego mycia w studzience, aż komórki będą gotowe do platerowania. Zainicjuj różnicowanie neuronów poprzez zbieranie, dysocjację i liczenie komórek. Talerz 1 x 10⁶ komórek w naczyniu o średnicy 6 cm w dniu -3.
9. W dniu 0 zbierz, zdysocjuj i policz komórki. Zasiać 1 x 10⁵ - 1,5 x 10⁵ komórek iMOP w 0,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej neurony na studzienkę w naczyniu z 24 dołkami. Odsysaj i dodawaj do kultur wstępnie ogrzane pożywki różnicujące neurony co drugi dzień.
10. Napraw neurony pochodzące z iMOP w 4% formaldehydzie przez 15 minut w RT w dniu 7. Usuń roztwór formaldehydu, przepłucz neurony pochodzące z iMOP buforem do płukania (1X PBS zawierający 0,1% TritonX-100) przed inkubacją w buforze blokującym (1X PBS zawierający 10% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100) przez 1 godzinę.
    1. Zastąp bufor i inkubuj próbki w buforze blokującym rozcieńczonym przeciwciałem. Inkubować w temperaturze 4 °C. Przemyć próbki 1X PBS zawierającym 0,1% komórek Triton X-100 poddanych barwieniu immunologicznemu. Umyj szkło nakrywkowe 1X PBS przed umieszczeniem na nośniku montażowym. Pozostawić nośnik montażowy do wyschnięcia w temperaturze 4 °C przed uzyskaniem obrazów epifluorescencji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 mm (okrągłe 12 mm)	Mikroskopia elektronowa 7	Nr kat. 72230-01
DMEM/F12	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11320-082
Podłoże nerwowo-podstawowe	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 21103
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10010-023
Suplement B27 (50X) Bez surowicy	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17504-044	Przechowywany w postaci podwielokrotności 1 ml
L-glutamina (200 mM)	Technologie życiowe	25030-081	Przechowywany w postaci podwielokrotności 5 ml
Naturalna mysz Laminin	Technologie życiowe	23017-015	Przechowywany w postaci podwielokrotności 1 mg/ml
Mocowanie przeciwblaknięcie Prolong Gold	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 47743-736	Przechowywany w postaci podwielokrotności 10 mg/ml 100 μl
Moxi Z Mini Automatyczny licznik komórek	Orflo	MXZ001
Kaseta Moxi Z Typ S	Orflo	MXC002
Poli-D-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P7886	Zawieszony w 1X PBS i przechowywany w postaci 10 mg/ml 100 μl podwielokrotności
Pipta 5 ml, pakowana pojedynczo, miękka okładka (200 sztuk w opakowaniu zbiorczym)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 1367811D
Pibuła 10 ml pakowana pojedynczo w miękką okładkę (200 sztuk w opakowaniu zbiorczym)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 1367811E
Płytka Biolite 24-dołkowa poddana działaniu hodowli tkankowej	Thermo Fisher Naukowy	130188
Płytka 6-dołkowa Biolite poddana działaniu kultur tkankowych	Thermo Fisher Naukowy	130184
Naczynie 6 cm poddane hodowli tkankowej	Thermo Fisher Naukowy	130181
EMD Millipore Millex Sterylna strzykawka Filtr PVDF Wielkość porów: 0,22 μm	Thermo Fisher Naukowy	SLGV033RS
Końcówki do pipet filtracyjnych TipOne, wydłużona końcówka filtra, 0,1 - 10 μl	USA Naukowe	Nr kat. 1120-3810
Końcówki do pipet filtrów TipOne 1 - 20 μl	USA Naukowe	Lata 1120-1810
Końcówki do pipet filtracyjnych TipOne 1 - 200 μl	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1120-8810
Końcówki do pipet filtracyjnych TipOne 101 - 1000 μl	USA Naukowe	Nr kat. 1126-7810
Probówki stożkowe 15 ml sterylne 20 worków po 25 probówek (500 probówek)	USA Naukowe	Numer katalogowy: 1475-0511
Probówki stożkowe 50 ml sterylne 20 worków po 25 probówek (500 probówek)	USA Naukowe	Lata 1500-1211