Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i mediów
Uwaga: Wszystkie informacje o materiałach, odczynnikach, narzędziach i instrumentach zgłoszone w protokole są określone w Tabeli Materiałów.
- Wszystkie narzędzia preparacyjne należy przeznaczyć na autoklaw i przechowywać w sterylnym miejscu. Użyj następujących narzędzi: 4 standardowe kleszcze (2 długie i 2 krótkie) i 2 nożyczki, a także 2 kleszczyki (1 długi i 1 krótki) oraz 1 nożyczki do sekcji; Zachowaj dodatkowy zestaw jako kopię zapasową.
- Przygotuj 100 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)/1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do użycia podczas mycia, procedur znakowania immunologicznego i etapów sortowania komórek. Roztwór przechowywać w stanie schłodzonym w temperaturze 4 °C.
nuta: Nie należy dodawać azydku sodu (NaN3) do roztworu, ponieważ może on być toksyczny dla żywych komórek.
- Przygotuj 100 ml PBS/1% FBS z 99 ml PBS i 1 ml FBS.
- Przygotować 100 ml sterylnej pożywki z komórek nerwowych uzupełnionej 3% FBS (patrz tabela materiałów) do użycia jako pożywka do pobierania i hodowli. Utrzymywać pożywkę do hodowli komórkowych w sterylnej temperaturze 4 °C. Przed użyciem należy go ogrzać tylko do temperatury pokojowej (RT).
- Przygotuj 100 ml pożywki z komórek nerwowych uzupełnionej 3% FBS, używając 97 ml pożywki z komórek nerwowych i 3 ml FBS.
- Probówki zbiorcze do wstępnego schładzania (probówki o pojemności 15 ml) wstępnie pokryte 5 ml pożywki zbiorczej poprzez umieszczenie ich w wiaderku na lód. Używaj wyłącznie rurek polipropylenowych, aby zapobiec przywieraniu komórek do powierzchni rurki.
- Umieść 40-milimetrowe szalki, nylonowe sitka 70 μm, strzykawki, tłuczki do sitka komórkowego i sterylne probówki polipropylenowe w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wysterylizuj wszystkie przedmioty przed zabiegami i utrzymuj je w sterylny sposób przez cały czas trwania zabiegów.
nuta: Wszystkie czynności po pobraniu siatkówki zostaną wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Przygotowanie zawiesiny komórek siatkówki
- Umieść zebrane oko na płycie podstawy mikroskopu preparacyjnego, aby rozpocząć sekcję rogówki. Przeanalizuj każde oko z osobna.
- Ostrożnie przytrzymaj gałkę u podstawy nerwu wzrokowego za pomocą kleszczy. Na tym etapie użyj jednego długiego i jednego krótkiego standardowego kleszcza.
- Użyj ostrej igły o rozmiarze 30 (30G), aby przebić rogówkę. Umożliwi to ewakuację cieczy wodnistej z oka, co ułatwi trzymanie oka kleszczami.
- Przytrzymaj rogówkę kleszczami i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w rogówce. Delikatnie obierz rogówkę i twardówkę za pomocą kleszczy. Gdy gałka jest oderwana do połowy, rozwałkuj siatkówkę i soczewkę za pomocą kleszczy. Wyrzuć rogówkę, twardówkę i soczewkę.
nuta: Ta metoda zapewnia, że siatkówka całkowicie odrywa się od pozostałej części oka.
- Umieść siatkówkę na małej 40-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS/1% FBS.
nuta: Jako alternatywę dla szalki Petriego można użyć szalki do hodowli komórkowych. Upewnij się, że siatkówka jest zawsze wilgotna, tak jak w warunkach fizjologicznych.
- Umyj każdą siatkówkę trzy razy świeżym sterylnym PBS/1% FBS w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Umieść do 12 siatkówek na sterylnym nylonowym sitku o grubości 70 μm zwilżonym PBS/1% FBS. Używając tylnego końca strzykawki o pojemności 10 ml, delikatnie maceruj siatkówkę, wykonując okrężne ruchy, aby odłączyć komórki.
- Alternatywnie, użyj tłuczka do maceracji sitka komórkowego lub użyj trawienia enzymatycznego z kombinacją 15 IU/ml papainy, 5 mM L-cysteiny i 200 U/ml DNazy I przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie inaktywacji PBS/10% FBS.
nuta: Nie zaobserwowano zmian w odsetku odzyskanych komórek, gdy trawienie enzymatyczne porównano z maceracją za pomocą tylnego końca strzykawki lub tłuczka.
- Aby przenieść izolowane komórki, umieść sterylne nylonowe sitko o średnicy 70 μm na probówce do pobierania polipropylenu. Przepuść zebrane komórki przez sitko za pomocą pipety P1000. Przepłukać sitko (krok 3.6) PBS/1% FBS, aby uwolnić pozostałe komórki i przenieść je do probówki zbiorczej.
- Dodaj PBS/1% FBS, aby uzyskać końcową objętość 1 ml na siatkówkę. Odwirowywać zawiesinę komórek przez 7 minut przy 200 x g i RT.
Uwaga: W zależności od liczby macerowanych siatkówek (< 6 siatkówek), osad komórek może być zbyt mały, aby był widoczny.
- Odrzucić supernatant komórkowy i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS/1% FBS, stosując proporcję 1 ml na 5 siatkówk.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Wyczyść szklany hemocytometr i szkiełko nakrywkowe 70% alkoholem. Delikatnie zakręć rurką zawierającą komórki, aby upewnić się, że zawiesina komórek siatkówki jest równomiernie rozprowadzona. Umieścić 20 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki i wymieszać z 20 μl zawiesiny komórek.
- Delikatnie wymieszać i nanieść 10 μl mieszaniny 0,4% błękitu trypanowego i zawiesiny komórek do hemocytometru, wypełniając obie komory; działanie kapilarne wciągnie 0,4% mieszaninę zawiesiny błękitu trypanowego/komórek pod szkiełko nakrywkowe. Za pomocą mikroskopu policz wszystkie trypanowe komórki niebiesko-ujemne; Ta liczba reprezentuje żywe komórki.
- Określ żywotność komórek za pomocą następującego wzoru: liczba żywych komórek / całkowita liczba komórek = % żywotności.
nuta: Jeśli żywotność komórek jest mniejsza niż 95%, do rozróżnienia żywotności komórek podczas sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) wymagany jest barwnik fluorescencyjny.
- Użyj fluorescencyjnego barwnika żywotności, który nie jest przepuszczalny dla żywych komórek. Umyj komórki PBS, aby usunąć wszelkie ślady surowicy. Dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego w celu rozróżnienia żywotności komórek na 5,0 x 106 komórek w końcowej objętości 100 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Dodaj 10 razy większą objętość PBS/1% FBS. Wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT.
- W razie potrzeby inkubować zawiesinę komórkową przez noc w temperaturze 4 °C. Jeśli tak się stanie, napełnij rurkę zawiesiny komórek pożywką z komórek nerwowych, a nie PBS/1% FBS. Umieścić probówkę poziomo i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C.
3. Znakowanie immunologiczne komórek siatkówki
- Użyj następującej konwersji, aby określić objętość przeciwciała na liczbę komórek: 2 μl przeciwciała na 5,0 x 106 komórek w objętości 100 μl.
- Umyj komórki i utrzymuj je w PBS/1% FBS. Pobrać małą porcję komórek (5,0 x 106 komórek) do wykorzystania jako kontrola ujemna (nieoznakowana) w czasie ustawiania sortowania.
nuta: Ta negatywna kontrola ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej kalibracji sortera komórek.
- Aby zminimalizować nieswoiste wiązanie przeciwciał z komórkami, które wyrażają receptory Fcγ II i III, dodaj 1 μl przeciwciała anty-mysiego CD16/32 na 1,0 x 106 komórek w 50-μl końcowej objętości przy użyciu PBS / 1% FBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać koktajl przeciwciał do próbki i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 30 minut w wiaderku z lodem. Upewnij się, że pojemnik na lód jest przykryty, ponieważ światło może zagrozić eksperymentowi z powodu fotowybielania oznaczonych fluoroforów.
- Przygotuj koktajl przeciwciał przy użyciu następujących znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał przeciw myszy: CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (fikoerytryna)-cyjanina7, CD15 PE i nieoznakowany CD57.
Uwaga: Dla każdego przeciwciała należy zastosować następujące stężenia na 5,0 x 106 komórek: CD90,2 AF700, 1 μg; CD48 PE-cyjanina7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; i nieoznakowany CD57, 0,4 μg.
- Należy użyć objętości zgodnie z poniższymi obliczeniami (w oparciu o dostępne na rynku przeciwciała wymienione w Tabeli materiałów): łącznie 5,0 x 107 komórek do znakowania; 2 μL na 5,0 x 106 komórek = 20 μL każdego przeciwciała; 4 różne przeciwciała = 80 μL koktajlu przeciwciał; końcowa objętość = [(5,0 x 10 7 całkowitych komórek)/5,0 x 106 komórki] x 100 = 1 000 μl; 80 μL Abs + 50 μL anty-mysiego CD16/32 + 870 μL PBS/1% FBS = 1 000 μL.
nuta: Ta kombinacja zapewniła optymalną kombinację fluorochromów dla konfiguracji instrumentu. Następujące parametry podsumowują emisję i wzbudzenie: AF-700, emisja 719 nm po wzbudzeniu czerwonym laserem diodowym o długości 638 nm; PE-cyjanina7, emisja 767 nm przy wzbudzeniu niebieskim laserem diodowym 488 nm; i PE, emisja 575 nm po wzbudzeniu niebieskim laserem diodowym o długości 488 nm.
- Po 30-minutowej inkubacji zwiększyć objętość do 5 ml za pomocą PBS/1% FBS. Przemyć próbki, odwirowując je przez 7 minut przy 200 x g i RT. Powtórzyć procedurę raz, aby usunąć wszystkie niezwiązane przeciwciała.
- Dodaj 2 μl przeciwciała drugorzędowego (0,1 μg), które zwiąże CD57 o wymiarach 5,0 x 106 komórek. Inkubować przez 30 minut w wiaderku z lodem, jak w kroku 3.4. Umyj komórki dwukrotnie, jak w kroku 3.5.
- Oznacz komórki przeciwciałem drugorzędowym, jeśli w kroku 3.4.
użyto nieoznakowanego przeciwciała pierwszorzędowego.
Uwaga: Przeciwciało drugorzędowe wybrane dla tej konfiguracji jest wymienione w Tabeli materiałów; Ma długość fali emisji 421 nm. Używaj go z filtrem pasmowoprzepustowym 450/50 nm po wzbudzeniu fioletowym laserem diodowym przy 405 nm.
- Objętości należy stosować zgodnie z poniższymi obliczeniami (w oparciu o dostępne na rynku przeciwciało wymienione w tabeli materiałów): 2 μL na 5,0 x 106 komórek = 20 μL przeciwciała drugorzędowego; objętość końcowa = [(5,0 x 10 7 komórek ogółem)/5,0 x 106 komórek] x 50 = 500 μL; 20 μL Abs + 480 μL PBS/1% FBS = 500 μL.
- Zachowaj oznaczone komórki w PBS/1% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru; stosować końcowe stężenie komórek siatkówki 3,0 - 4,0 x 107 komórek/ml.
nuta: Nie używaj pożywki do hodowli komórkowych do rozcieńczania komórek, ponieważ czerwień fenolowa może zwiększyć autofluorescencję, zmniejszając w ten sposób rozdzielczość między komórkami ujemnymi i dodatnimi. Końcowe stężenie ogniwa na objętość w dużym stopniu zależy od objętościowego natężenia przepływu w konfiguracji urządzenia.
- Podczas konfiguracji używaj jednokolorowych elementów sterujących, aby zminimalizować rozlewanie się fluorescencji.
nuta: Ten krok, znany również jako kompensacja, jest stosowany w celu skorygowania szumu powstałego w wyniku połączenia fluoroforów. Mikrosfery polistyrenowe w PBS/0,1% BSA/2 mM NaN3 ze zdolnością wiązania znakowanych fluorescencyjnie izotypów immunoglobuliny (Ig) z wielu gatunków zapewniają pozytywne kontrole w celu ustalenia kompensacji.
- Umieść 3 krople mikrosfer polistyrenu w sterylnych probówkach FACS, przydzielając po jednej na fluorofor. Dodać 1 μg odpowiedniego fluoroforu do każdej probówki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Dodać 3 ml PBS/1% FBS do probówek z próbkami. Wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 250 μl PBS/1% FBS.
- Aby ustawić kontrole negatywne, użyj mikrosfer polistyrenu, które nie wiążą się z Ig. W razie potrzeby wykonaj ten krok dzień wcześniej.