$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
UWAGA: Krótko mówiąc, fibroblasty zostały przeprogramowane na iPSC poprzez genetyczne przeprogramowanie oparte na mRNA. iPSC utrzymywano w pożywce z komórek macierzystych (SCM) (patrz lista materiałów) i przechowywano w gęstości ~1,2 x 102 komórek/ml z 1 ml SCM, 10 μM z inhibitorem kinazy białkowej związanej z rho (ROCKi) Y-27632 i 10% (v/v) siarczkiem dimetylu (DMSO), w kriokonserwowanych fiolkach w ciekłym azocie w temperaturze -160 °C. Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Rozcieńczanie matrycy membrany podstawnej i powlekanie płyt
- Rozcieńczony (1:50) czynnik wzrostu zmniejszył macierz błony podstawnej oczyszczony z guza Engelbreth-Holm-Swarm w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej.
- Pokryć płytki do hodowli komórkowych odpowiednią ilością rozcieńczonej matrycy błony podstawnej (tj. płytka 6-dołkowa = 1 ml, płytka 12-dołkowa = 0,5 ml) i inkubować te płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
2. Utrzymanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)
UWAGA: Maksymalna konfluencja na studnię w 6-dołkowej płycie z płaskim dnem wynosi ~1,2 x 106 komórek.
- Rozmrozić kriokonserwowane iPSC do SCM za pomocą 10 μM Y-27632 i płytkę na 6-dołkowej płytce pokrytej rozcieńczoną matrycą błony podstawnej zredukowanej przez czynnik wzrostu.
- Utrzymuj iPSC w SCM za pomocą 10 μM Y-27632 przez pierwsze 24 godziny po rozmrożeniu. Przełącz się na świeże podłoże po 24 godzinach.
- Utrzymuj iPSC w SCM, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji przed pasażacją.
- Oblicz, ile iPSC będzie potrzebnych do różnicowania, mnożąc pożądaną gęstość do różnicowania (15 600 komórek/cm2) przez powierzchnię studzienki. W przypadku 6-dołkowej płytki z płaskim dnem pomnóż 15 600 komórek/cm2 przez 9,6cm2, co daje w sumie 149 760 komórek/studzienkę.
- Aby przejść, umyj komórki zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBBS). Następnie inkubować komórki z nieenzymatycznym kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (patrz wykaz materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie podnieść komórki. Zbierz komórki w świeżym SCM.
- Umieść komórki na płytkach do hodowli komórkowych pokrytych rozcieńczonym SCM i utrzymuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3 lub przechowuj je w temperaturze ~1,2 x 106 komórek/ml w 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 i 10% DMSO (v/v) w kriokonserwowanych fiolkach w ciekłym azocie w temperaturze -160 °C.
3. Różnicowanie iPSC na BMEC
UWAGA: Nieenzymatyczne EDTA rozdziela komórki na grudki. Enzymatyczne EDTA (patrz tabela materiałów) rozdziela komórki na zawiesinę jednokomórkową. Kwas retinowy (RZS) należy chronić przed światłem.
- Jednokrotne umycie iPSC solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (DPBS) firmy Dulbecco. Inkubować z enzymatycznym EDTA (1 ml dla płytki 6-dołkowej, 0,5 ml dla płytki 12-dołkowej i 0,25 ml dla płytki 24-dołkowej) przez około 5 minut w temperaturze 37 °C, aby otrzymać zawiesinę jednokomórkową.
- Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g (względna siła odśrodkowa) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osady komórkowe w SCM zawierające 10 μM Y-27632.
- Określ gęstość komórek za pomocą Trypan Blue i automatycznego licznika komórek lub urządzenia do hemocytometru. Płytki o gęstości 15 600 komórek/cm2 lub 149 760 komórek/basenik 6-dołkowej płytki z płaskim dnem (o powierzchni 9,6 cm2/basenik) w SCM zawierającym 10 μM Y-27632 przez 24 godziny.
- Rozpocznij różnicowanie po 24 godzinach, zmieniając pożywkę SCM na E6. Zmieniaj pożywkę E6 codziennie przez następne 4 dni.
- W 4 dniu różnicowania zastąp pożywkę E6 pożywką wolną od ludzkiej surowicy śródbłonka (hESFM) uzupełnioną rozcieńczonym (1:200) suplementem witaminy B27, 20 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 10 μM RA. Nie zmieniaj tego podłoża przez następne 48 godzin.
- Przygotować 200 ml hESFM z rozcieńczoną (1:200) witaminą B27, wymieszać 1 ml 50x skoncentrowanego suplementu B27 ze 199 ml hESFM.
- Przygotować 20 ng/ml bFGF, rozpuszczając 50 μg bFGF w 250 μl buforu Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mMchlorek sodu, NaCl) w celu uzyskania 200 μg/ml roztworu podstawowego. Przygotować 200 ml hESFM zawierającego 20 ng/ml bFGF, mieszając 20 μl 200 μg/ml bFGF z 200 ml hESFM.
- Przygotować 10 μM RA, najpierw sporządzając 40 mg/ml roztworu podstawowego RA, dodając 2,5 ml DMSO do 100 mg proszku RA. Rozcieńczyć to stężenie do 3 mg/ml, aby uzyskać 10 mM roztwór podstawowy. Przygotować 200 ml hESFM zawierającego 10 μM RZS, mieszając 200 μL 10 μM RA w 200 ml hESFM.
4. Kolagen powlekający IV (COL4) i matrycę fibronektyny (FN) do oczyszczania BMEC pochodzącego z iPSC
- Dodać 2 ml sterylnej wody do 2 mg FN, aby uzyskać 1 mg/ml roztworu podstawowego FN. Dodać 5 ml sterylnej wody do 5 mg COL4, aby uzyskać roztwór podstawowy COL4 o stężeniu 1 mg/mL.
- Pozostawić FN do rozpuszczenia przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C, a COL4 do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy FN w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 100 μg/ml, a roztwór podstawowy COL4 do końcowego stężenia 400 μg/ml.
- Pokryj żądane płytki (płytka 6-dołkowa = 1 ml roztworu COL4/FN, płytka 12-dołkowa = 0,5 ml, płytka 24-dołkowa = 0,25 ml i płytka 12-transwell z filtrem = 0,25 ml) mieszaniną 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN.
- Inkubować płytki przez co najmniej 2 godziny lub przez noc w temperaturze 37°C; w przypadku płytek z filtrem Transwell zaleca się co najmniej 4 godziny.
5. Subkultura i oczyszczanie BMEC pochodzących z iPSC
UWAGA: Inkubacja z enzymatycznym EDTA może trwać dłużej niż 15 minut, w zależności od zbiegu komórek w 6 dniu różnicowania.
- W 6 dniu różnicowania przemyć komórki dwukrotnie DPBS. Inkubować z 1 ml enzymatycznego EDTA przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
- Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić granulki komórkowe świeżym hESFM z rozcieńczonym (1:200) suplementem B27, 20 ng / ml bFGF i 10 μM RA.
- Komórki nasienne na płytkach pokrytych mieszaniną 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN. Komórki nasienne przy użyciu stosunku 1 dołka płytki 6-dołkowej do 3 dołków płytki 12-dołkowej, 3 dołków płytki 12-dołkowej lub 6 dołków płytki 24-dołkowej.